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雷帕霉素靶标蛋白(Target ofrapamycin,TOR)属于磷脂酰肌醇激酶PI3K家族的Ser/Thr类蛋白激酶,动物mTOR可以与多种蛋白结合形成两种组分和功能不同的多蛋白复合物 TORC1 和 TORC2,其中 TORC1 由 mTOR、Regulatory associate protein of TOR(Raptor)和 lethal sec-13 protein8(mLST8)组成。Raptor 作为 TORC1复合体的核心成员担负着募集TOR蛋白底物的功能。TORC1信号通路主要通过响应营养供给、生长因子、能量状态和环境胁迫而调控细胞的生长和代谢等生物过程,是调控细胞生长的主导者。核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 kinase,S6K)是TORC1信号通路下游最直接而又关键的靶蛋白,广泛参与不同的生命活动过程包括核糖体RNA合成、蛋白质翻译及稳定、细胞周期、转录调控及营养运输等重要生理过程。研究表明动物TOR/Raptor/S6K中任一成员的缺失均可导致胚胎致死及生长严重受阻。目前,人们对植物TOR/Raptor/S6K的认识极为有限。TOR/Raptor/S6K在植物胚后生长发育过程中的生物学功能有待进一步探索。植物属于自养型生物,其生长发育存在不同于动物的调控模式和分子机制。为进一步阐明TOR/Raptor/S6K在植物生长发育中的作用,本研究通过分子遗传操作、蛋白表达、基因缺失突变、RNAi干扰、分子互作、代谢组分析、药理处理、细胞超微观察及转录分析等技术从分子、遗传、代谢、细胞学和生化等方面阐明水稻TOR/Raptor/S6K在植物生长中的作用和分子调控机制。结果表明TOR/Raptor2/S6K1协同性地调控叶绿体类囊体膜脂形成、脂质稳态和类囊体基粒片层结构的稳定,进而调控植物生长。具体研究结果如下:水稻基因组含有两个S6Ks即S6K1和S6K2,其功能尚不清楚。本研究首先从水稻中克隆S6Ks基因,分析其时空调控方式和酶特性。结果表明从苗期、分蘖期到抽穗期,S6K1在根中的表达水平一直保持较高水平,而S6K1在叶片中的表达水平一直高于S6K2,且在生长前期表达远高于后期,S6K2基因的表达水平随着植物生长发育进程逐渐下降。观察发现GFP-S6K1荧光融合蛋白在细胞质和细胞核均有表达,而GFP-S6K2则主要定位在细胞核中。这些结果表明水稻S6K1和S6K2时空分布和调控方式各不相同,也暗示了其生物功能的差异性和独特性。本研究表明水稻S6K1编码的蛋白具有催化人类rpS6共有保守多肽序列(KRRRLASLR)磷酸化的活性,表明水稻S6K1与哺乳动物p70S6K1在激酶活性和催化位点方面具有高度的保守性。为进一步阐明S6K1在水稻生长发育中的作用,本研究分离了一个T-DNA插入5’-UTR纯合突变体s6k1,该突变体S6K1基因表达水平只有野生型中的20%。观察发现在正常生长条件下s6k1纯合突变体生长受到明显抑制,其叶片为浅黄绿色,叶绿素a含量下降29%,光合作用效率仅为野生型的27%。s6k1可溶性糖和淀粉含量仅为野生型的85%和57%。超微结构观察发现,s6k1纯合突变体叶片叶绿体类囊体垛叠基粒片层结构松散或缺陷,并伴随大量增加的脂质小体,而野生型叶片叶绿体内含有紧密垛叠、结构清晰的类囊体基粒片层结构。说明S6K1缺失导致叶绿体类囊体基粒片层膜结构塌陷,进而导致其叶片黄化,表明S6K1在调控叶绿体类囊体基粒片层结构的稳定性中起重要作用,并调控光合作用和植株生长发育。利用Pull-down和Co-IP技术分析表明S6K1可与Raptor2直接互作,且S6K1活性受Raptor2所调控。进一步分析发现水稻Raptor2缺失突变体raptor2在生长前期特别是在分蘖期间的叶片出现白色条纹或完全白化。超微结构观察发现raptor2突变体叶片类囊体垛叠的基粒片层结构塌陷或严重缺失,与s6k1突变体极为类似甚至更严重。表明S6K1与Raptor2直接互作,并共同参与调控叶绿体类囊体膜基粒片层结构塑造过程。为了解Raptor2/S6K1缺失出现的叶色黄化或白化现象是否受TOR活性的调控,本研究分析了 TOR活性受抑制后产生的生物学效应。结果发现水稻叶片的S6K磷酸化水平被TOR特异性抑制剂显著抑制,且下降水平与抑制剂浓度正相关,这些结果表明TOR/Raptor2/S6K1任一成员的缺失均可导致水稻叶片黄化、叶绿素含量降低,说明三个成员均参与叶绿体类囊体膜形成和基粒片层建构。膜脂是类囊体基粒片层的骨架成分,通过脂质代谢分析发现TOR/Raptor2/S6K1任一成员的缺失均导致糖脂MGDG和DGDG绝对含量的显著降低,并伴随着糖脂合成代谢相关基因MGD1、DGD1和LPPα5的转录水平下调。表明TOR/Raptor2/S6K1三个成员协同性参与叶绿体类囊体膜合成代谢和基粒片层建构的调控过程,从而确保植物正常光合作用,为植物自身生长发育提供了糖类和能量。S6K1基因的下调也导致植株生长显著受阻,包括株高、分蘖数和生物产量都明显低于野生型。这些缺失的表型均可因S6K1回补而得到回复,说明水稻S6K1对于维持植株正常的生长方面具有重要的调控作用。此外,S6K1的缺失对根生长、根毛发育、花粉育性、维管束细胞及气孔保卫细胞等方面也产生明显影响,在生长发育方面具有多效性。进一步分析表明S6K1与控制细胞周期相关的转录因子E2F3存在互作,其相互作用促使E2F3在核内表达量的明显增强。