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背景乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,与其他分子病理类型相比,三阴性乳腺癌具有侵袭性高、发病年龄早、复发迁移率高、生存期短、临床预后差等特点。随着现代诊疗技术的发展,乳腺癌早期诊断率明显提高、5年生存明显改善,但中晚期三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer TNBC)治疗尚未获得更为明显进展。而由于其分子特异性,到目前为止,靶向治疗并没有显著提高TNBC患者的生存率,化疗仍然是治疗的标准。虽然许多TNBC早期患者可以通过化疗治愈,但在那些已经发生迁移的患者中,目前治疗方案的中位总生存期仅为13至18个月。LncRNA NRON是一种长度约为2.7 kb,由3个外显子组成的长链非编码RNA,可选择性剪接产生大小从0.8 kb到3.7 kb不等的转录,其富集于肌肉(包括心肌)、胎盘、脾脏、胸腺和淋巴结,由于其可通过影响活化T细胞的核转运,被认为是活化T细胞核因子的抑制因子,经鉴定为调控T细胞的核转运,被认为在肝癌、前列腺癌、淋巴瘤细胞侵袭、迁移和血管生成中发挥重要作用,研究显示敲除LncRNANRON后,肿瘤细胞增殖、侵袭能力明显增强。但LncRNA NRON在乳腺癌中的表达情况尚未在国内外研究中报道。我们前期研究发现LncRNA NRON在三阴性乳腺癌中低表达,本研究尝试通过从临床分析、实验验证、机制研究三部分,验证LncRNA NRON在三阴性乳腺癌中的表达情况及其内在的可能机制,为临床诊疗三阴性乳腺癌提供参考依据。目的1.检测三阴性乳腺癌组织LncRNANRON的表达水平,分析其表达水平对总生存期的影响及其与影响预后的因素的关系,明确LncRNA NRON的表达在三阴性乳腺癌中的意义;2.上调LncRNANRON表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用;3.上调LncRNANRON表达对乳腺癌细胞作用机制的初步分析。第一部分 LncRNANRON在三阴性乳腺癌组织中表达及意义方法:1.选取河南省肿瘤医院穿刺后患者病理标本及癌旁组织行苏木精-伊红染色法染色及免疫组化检查,筛选三阴性乳腺癌病理标本;2.应用定量即时聚合酶链锁反应方法检测LncRNANRON在三阴性乳腺癌组织及癌旁组织中的表达差异;3.通过单因素方差分析和COX风险回归分析影响预后的因素,明确LncRNANRON与影响预后的因素的关系及其对总生存的影响,探讨其对三阴性乳腺癌预后的预测意义。结果:1.通过HE染色鉴别出良、恶性肿瘤,应用免疫组化检测雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素(Progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体 2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、Ki67 的表达情况,筛选出ER<1%、PR<1%、HER2(-)的患者共70例;2.应用RT-qPCR方法对三阴性乳腺癌组织及癌旁组织检测结果显示,与癌旁乳腺组比较,三阴性乳腺癌组织中LncRNA NRON明显下调,差异有统计学意义(P<0.0001);3.入组患者中位随访时间为29.5月(1-54月),随访结束后共有21例患者死亡(均因乳腺癌去世),49例存活;三阴乳腺癌患者总生存与临床分期、是否内脏转移、LncRNA NRON有关;三阴性乳腺癌患者LncRNA NRON表达水平与临床分期呈负相关,且表现出随肿瘤临床分期增高而表达降低;LncRNA NRON表达越高的TNBC患者,生存时间越长。第二部分 上调LncRNA NRON表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响方法:1.构建LncRNANRON的慢病毒表达载体,包装纯化得到LncRNANRON表达的慢病毒;2.建立上调LncRNA NRON乳腺癌细胞株;RT-qPCR检测LncRNA NRON的表达水平,鉴定上调LncRNANRON乳腺癌细胞株成功;3.CCK-8实验测定上调LncRNANRON表达对乳腺癌细胞增殖的影响;4.Transwell实验检测上调LncRNA NRON表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响;5.Western-blot检测基质金属蛋白酶抑制因子2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2,TIMP2),基质金属蛋白酶 2(Matrix metalloproteinase-2,MMP2)的表达水平,测定上调LncRNA NRON表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响;6.裸鼠移植瘤实验,测定体内上调LncRNANRON表达对乳腺癌细胞增殖的影响,行RT-qPCR检测移植瘤中LncRNANRON表达水平。结果:1.提取人类基因组DNA为模板,用设定引物行PCR扩增,克隆入慢病毒表达载体LV6。测序分析显示插入片段序列结果与目的基因一致;2.通过转染方法构建LncRNA NRON过表达细胞系;通过RT-qPCR检测LncRNANRON表达情况,在Hs578T、BT-549细胞系过表达组中LncRNA NRON表达量明显升高(P<0.001),提示LncRNA NRON稳定过表达细胞系构建成功;3.CCK-8结果显示在Hs578T、BT-549细胞系中LncRNA NRON过表达明显抑制了细胞增殖(P<0.001);4.Transwell实验显示Hs578T、BT-549细胞系中LncRNA NRON过表达明显抑制了细胞侵袭、迁移(P<0.001);5.Western blot 实验显示在 Hs578T、BT-549 细胞系中,LncRNANRON 表达组细胞中TIMP2水平明显增高(P<0.05),同时伴随MMP2的表达水平明显降低(P<0.001),提示,LncRNANRON过表达抑制了三阴性乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力;6.上调LncRNA NRON表达可使三阴性乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤体积、重量明显降低(P<0.05),移植瘤中过表达组LncRNANRON表达水平明显升高(P<0.001),提示上调LncRNA NRON表达可显著抑制裸鼠移植瘤的成瘤能力。第三部分 上调LncRNA NRON表达对乳腺癌细胞作用机制的初步分析方法:1.依据生物信息学分析结果“LncRNA NRON序列中存在与miR-3658结合的吸附位点”,应用双荧光素酶实验证实两者的结合,RT-qPCR检测上调LncRNA NRON表达对乳腺癌细胞株miR-3658表达影响;2.合成miR-3658 Inhibitor,转染乳腺癌细胞株(Hs578T、BT-549),应用CCK-8方法、Transwell方法检测下调miR-3658表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用;3.用双荧光素酶实验和Western-blot方法检测miR-3658对TIMP2表达的影响;4.合成si-TIMP2,应用CCK-8方法、Transwell方法检测沉默TIMP2表达对上调LncRNANRON和下调miR-3658导致效应的回复作用。结果:1.我们通过生物学信息预测LncRNA NRON与miR-3658存在潜在结合位点;在双荧光素酶报告实验结果显示,同时转染miR-3658和野生型LncRNA NRON潜在结合位点的细胞,荧光酶素表达活性下降(P<0.001);RT-qPCR检测在Hs578T、BT-549细胞系LncRNANRON过表达组中miR-3658表达水平明显下降(P<0.001),这部分实验共同说明:LncRNANRON可以通过其序列中片段与miR-3658结合位点结合,且对miR-3658表达水平起负调控作用,证实生物预测信息分析正确;2.CCK-8结果显示在Hs578T、BT-549细胞系中下调miR-3658表达明显抑制了细胞增殖能力(P<0.001);Transwell实验显示Hs578T、BT-549细胞系中下调miR-3658表达明显抑制了细胞侵袭、迁移能力(P<0.001);这提示下调miR-3658表达可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力;3.生物学信息分析TIMP2存在与miR-3658的共同结合位点;在双荧光素酶报告实验中,同时转染miR-3658和野生型TIMP2潜在结合位点的细胞,荧光酶素表达活性下降(P<0.001);用Western blot方法检测在Hs578T、BT-549细胞系中,下调miR-3658表达细胞中TIMP2水平明显增高(P<0.001);这部分实验共同证实了 TIMP2是受miR-3658调控的靶基因;4.三阴性乳腺癌细胞中上调LncRNANRON同时沉默TIMP2,可部分解除对细胞增殖、侵袭的抑制作用;三阴性乳腺癌细胞中下调miR-3658同时沉默TIMP2,可部分解除对细胞增殖、侵袭的抑制作用。这部分实验显示:上调LncRNANRON和下调miR-3658抑制肿瘤细胞增殖、侵袭能力都需通过TIMP2这个环节来发挥作用。结论:1.在三阴性乳腺癌组织中LncRNANRON呈现低表达,LncRNANRON表达水平与临床分期呈负相关,且表现出随肿瘤临床分期增高而表达降低;LncRNANRON表达高的患者,生存时间较长;2.LncRNANRON过表达可明显抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移;可显著抑制裸鼠移植瘤的生长;3.LncRNA NRON抑制三阴性乳腺癌的机制可能是通过ceRNA方式吸附miR-3658,进而调控TIMP2表达实现的:4.LncRNANRON过表达可抑制三阴性乳腺的发生发展,这可能为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的靶点。