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目的:
1.选用本实验室已制备的HER2/neu的CTL和B细胞联合表位的纯化融合蛋白,即ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149。将这三种纯化的表位融合蛋白ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149和pET32a载体蛋白Trx-His分别免疫BALB/c小鼠,制备鼠血清抗体,采用间接ELISA方法及Westernblot法初步分析HER2/neu联合表位肽的免疫原性。并用HER2/neu高表达的乳腺癌SK-BR-3细胞制备的抗原作为包被抗原,检测表位融合蛋白鼠血清抗体效价,以进一步探讨HER2/neu的CTL和B细胞联合表位诱导抗体与HER2/neu抗原结合能力,为HER2/neu相关胃肠道肿瘤的疫苗设计奠定基础。
2.将HER2/neu的CTL和B细胞联合表位的纯化表位融合蛋白ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149作诊断抗原,采用间接ELISA方法检测胃癌患者(225例)、乳腺癌患者(110例)、慢性胃炎患者(120例)以及健康对照组(115例)血清中特异性抗体水平,分析HER2/neu的CTL和B细胞联合表位融合蛋白作为特异性抗原的可行性,以及ELISA方法检测不同临床分期的胃癌患者血清HER2/neu的表达情况,评估HER2/neu表达与胃癌临床分期的相关性,为HER2/neu相关胃肠道肿瘤研制诊断试剂提供了理论基础和实验依据。
方法:
1.取用本实验室已经制备的HER2/neu的CTL和B细胞联合表位的纯化融合蛋白ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149[1]。选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠,分5组,即HER2/neu多表位融合蛋白组、Trx-His蛋白组及PBS组,每组3只。采用背部皮下多点注射的方分别以纯化融合表位蛋白及Trx-His蛋白(阴性对照)和PBS(空白对照)作为免疫原与佐剂等体积混匀后按照50μg/只剂量,分别于第0w、3w、5w和7w免疫雌性BALB/c小鼠(3只/组),于第0w及免疫后3w、5w和7w,每次行尾静脉取血,制备免疫血清抗体。采用间接ELISA方法检测不同免疫时间表位融合蛋白鼠血清抗体效价及诱导抗体与HER2/neu抗原结合能力,分析其免疫原性。根据ELISA结果,Westernblot分析采用第7w免疫小鼠血清为一抗,Trx-His蛋白为阴性对照,进一步检测三种联合表位肽与特异性抗体的结合(图6)。
2.将纯化融合蛋白ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149作为诊断抗原,采用间接ELISA法分别检测胃癌患者、乳腺癌患者、慢性胃炎患者及健康对照组血清标本中HER2/neu抗体水平,以及不同临床分期的胃癌患者血清HER2/neu抗体的检测情况。根据健康对照组血清抗体的平均A值计算出阳性判定值(Cutoff值)(健康对照组血清抗体平均A值+3SD),以此评估胃癌患者和乳腺癌患者血清抗体阳性检出率,并分析HER2/neu血清抗体水平与胃癌临床分期的相关性。
3.统计学分析:采用SPSS16.0统计软件进行分析,各组小鼠血清与HER2/neu抗原结合的抗体效价比较采用t检验,各组小鼠血清及病人血清的ELISA检测结果用方差分析检验,各组间血清抗体阳性率的比较采用x2检验法,显著性检验水平均为0.05。
结果:
1.表位融合蛋白免疫BALB/c小鼠血清学检测,表明制备的三种表位融合蛋白均能刺激机体产生特异性抗体,第3w抗体效价已明显升高,随免疫次数增加而升高,可持续至第7w;所诱导产生的抗体均能与HER2/neu抗原结合。重复测量方差分析,四次测定时间之间有统计学意义(P=0.000<0.05);三种表位蛋白、Trx-His、PBS组间效应的方差分析结果显示各组间有统计学差异(P=0.000<0.05)。用t检验分析,ozlf-139/140、ozlf-146/147、ozlf-148/149免疫获得的抗体效价与Trx-His蛋白免疫获得的抗体效价均有显著性差异。(P=0.000<0.01)。以第7w免疫小鼠血清作为一抗进行Westernblot分析,显示3个HER2/neu的CTL和B细胞联合细胞表位蛋白在相对分子质量.约20kDa处出现特异性阳性信号条带而Tx-His蛋白阴性。
2.以三种表位融合蛋白作为抗原检测胃癌患者、乳腺癌患者、慢性胃炎患者及健康对照者血清标本中HER2/neu抗体均值分别为:乳腺癌组(0.401±0.175)、(0.346±0.130)和(0.465±0.328);胃癌组(0.243±0.167),(0.233±0.144)和(0.193±0.157):慢性胃炎组(0.172±0.060),(0.093±0.054)和(0.132±0.059);健康对照组(0.058±0.031),(0.054±0.024)和(0.072±0.036)。根据健康对照组血清抗体的平均A值计算出的Cutof分别为:0.151,0.126和0.180。三个融合表位分别检测四个组别血清HER2/neu抗体阳性率结果分别为:乳腺癌患者77.27%,61.18%和72.73%;胃癌患者37.78%,34.22%和28.44%;慢性胃炎患者10.83%,6.67%和4.17%和健康对照组4.35%,2.61%和1.17%,用卡方检验分析,三个融合表位检测乳腺癌组分别与慢性胃炎组及健康对照组的HER2/neu血清抗体效价的阳性率有显著性差异(P=0.000<0.01);三个融合蛋白检测胃癌组亦分别与慢性胃炎组及健康对照组的HER2/neu血清抗体效价的阳性率有显著性差异(P=0.000<0.01);三个融合蛋白检测的阳性率慢性胃炎组与健康对照组比较无统计学意义。(P139=0.051,P146=0.122,P148=0.061,P>0.05)(表2a,图2a-2c)表明三种融合蛋白作为诊断抗原,对乳腺癌患者、胃癌患者(即HER2/neu相关疾病组)的血清特异性抗体具有一定的诊断价值。按胃癌TNM分期进行分类,用方差检验分析5组临床分期间胃癌患者HER2/neu抗体水平OD均值,P值均大于0.05,未见明显差异。
结论:
1.ozlf-139/146、ozlf-146/147、ozlf-148/149表位融合蛋白免疫BALB/c小鼠血清学检测,表明预测的3个CTL和B细胞联合表位融合蛋白均能刺激机体产生特异性抗体,抗体效价随免疫次数增加而升高;表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与HER2/neu抗原结合,表明三种融合蛋白具有较强的免疫原性,为HER2/neu相关疾病基因工程疫苗的设计提供了理论基础和实验依据。
2.以ozfl-139/140、ozfl-146/147、ozfl-148/149三种融合蛋白作为诊断抗原,用ELISA法检测胃癌患者、乳腺癌患者、慢性胃炎患者和健康对照者血清特异性抗体,提示三种融合蛋白具较强的抗原性,对胃癌及乳腺癌诊断试剂的研究奠定了基础。
3.以三种融合蛋白作为诊断抗原,用ELISA法检测了不同临床分期的胃癌患者,为HER2/neu抗原的血清学检测在胃癌中的进一步研究提供实验参考。