论文部分内容阅读
随着年轻肿瘤患者的发病率和治愈率的不断提高,以及放化疗所带来的不同程度的生育功能损害,年轻肿瘤病人保护和保留生育功能的诉求越来越迫切。作为增殖分化极度活跃的器官,睾丸是辐射和化疗药物的敏感靶标之一。开发一种用于防治放化疗所致雄性生殖系统损伤的药物能够为患者提供更高的生活质量。TLR5配体鞭毛蛋白衍生物CBLB502通过TLR5依赖途径激活NF-κB信号通路,有效地减轻电离辐射引起的造血细胞、肠道上皮细胞和血管内皮细胞的凋亡,并促进再生,是目前最有潜在价值的辐射防护药物之一。CBLB502对多种实体肿瘤,肝毒性物质以及化疗药物引起的组织和器官损伤有广泛的抑制作用。本文对CBLB502对辐射所致小鼠生殖系统的保护作用及机制进行了探究,并为CBLB502用于临床上白血病的联合治疗提供了依据。第一部分:将160只C57BL/6J小鼠,随机分为四组:正常对照组(假照射,Sham)、CBLB502单独给药组(502)、5 Gyγ射线照射组(5 Gy)和CBLB502预处理组(5 Gy+502);CBLB502预处理组在照射前30 min注射20 mg/kg CBLB502。在照射后第1天、3天、7天、15天、30天、60天和120天观察小鼠的各项生殖指标。用SCA精子图像分析系统分析附睾中精子总数和活动度,伊红染色分析精子的畸形率。结果发现辐照后30天CBLB502预处理组明显改善辐射引起的精子总数减少(p<0.05)和活动度下降(p<0.05),降低精子畸形率(p<0.001)。睾丸脏器指数显示CBLB502可以减轻睾丸体积和重量的萎缩(p<0.05)。睾丸组织H&E染色结果显示辐射后睾丸病理损伤从第1天到第60天持续加重,生精小管排列完全紊乱,腔内精子消失殆尽,仅残留支持细胞和少量精原细胞。CBLB502预处理组的损伤程度明显减轻,第7天才可见腔内精子数量减少,第30天,生精上皮厚薄不均,排列疏松,之后便开始恢复。流式细胞术检测睾丸内单倍体细胞比例,CBLB502预处理组明显高于辐射对照组(53.49±2.46%vs 34.99±2.23%;p<0.001)。辐照后70天(约2个小鼠生精周期)将雄性小鼠与雌鼠按照1:2的比例合笼配对,2周后CBLB502预处理与辐照组相比,雌鼠的受孕率40.0%提高到73.3%,窝仔数由4.18±1.23只/窝增加到6.13±1.41只/窝。以上结果表明,CBLB502可以提高精子的活动度和精子数量,减少精子畸形,保护睾丸组织结构完整,提高小鼠的生育能力。TUNEL检测辐照后12 h睾丸细胞凋亡,结果显示CBLB502预处理组小鼠每个生精小管内平均TUNEL阳性细胞数显著低于辐射对照组(4.80±0.80 vs 8.69±0.93,p<0.05),表明CBLB502能减少细胞凋亡。彗星电泳方法检测睾丸细胞内DNA损伤,通过分析慧尾DNA比例,发现CBLB502可明显减轻辐射所致DNA损伤(p<0.01)。骨髓细胞染色体畸形率试验显示,CBLB502预处理组畸形率低于辐射对照组(p<0.05),而且其后代染色体畸形率也明显低于辐照组后代(p<0.05),接近正常对照组比例。以上表明CBLB502预处理可以减轻DNA损伤,降低染色体畸形,减少细胞凋亡,降低遗传毒性。试剂盒检测辐照后4 h睾丸组织内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。结果显示,CBLB502预处理显著增加睾丸组织中SOD的含量,及时清除电离产生的超氧自由基,降低脂质过氧化的产物MDA的含量,有效缓解ROS对生物膜的过氧化损伤。ELISA方法检测血清中睾酮(T)、黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)含量。CBLB502预处理的睾酮水平是辐照对照组的2倍(p<0.05),LH和FSH两组之间没有显著差异。Real-time PCR结果显示,相比于辐射对照组,CBLB502上调抑制素B(INH B)mRNA的表达,而雄激素结合蛋白(ABP)没有明显差异。睾酮主要由间质细胞产生分泌的,抑制素B是支持细胞的产物,表明CBLB502可以协助维持睾丸结构完整和内分泌环境的稳定。CBLB502预处理的Tlr5基因缺失小鼠其对生殖系统的辐射保护效果明显低于CBLB502预处理野生型的小鼠。直接证明CBLB502主要通过TLR5信号通路保护睾丸组织免受辐射损伤。利用Real-time PCR、Western blot和免疫组化的方法主要分析了NF-κB和p53相关信号通路。结果表明电离辐射激活p53,引起下游p21、Bax(促凋亡蛋白)和Caspase-3的表达上调,继而导致细胞凋亡;而CBLB502预处理可以明显下调这些基因和蛋白表达。CBLB502预处理小鼠显著增强p65磷酸化,激活NF-κB信号通路,上调Bcl-2(抑凋亡蛋白)的表达。相比于辐射对照组,CBLB502明显上调增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,参与细胞DNA的损伤修复。第二部分:文献提示CBLB502对造血系统具有辐射防护作用,那么CBLB502在保护骨髓造血细胞的同时,是否会保护白血病细胞或影响白血病的治疗的研究显得十分重要。为此我们利用人红白血病K562细胞进行了探讨。首先C57BL/6J小鼠在6.5 Gyγ射线全身照射前30 min,腹腔分别注射CBLB502、PBS、氨磷汀(WR2721),观察骨髓造血祖细胞集落形成情况。结果显示CBLB502预处理组BFU-E(爆式红系集落形成单位)、CFU-MK(巨核细胞集落形成单位)和CFU-GM(粒细胞-单核细胞集落生成单位)的数目均明显好于PBS和氨磷汀。CBLB502能刺激各系造血祖细胞向成熟造血细胞分化,促进造血恢复。流式细胞术和免疫印迹结果显示K562细胞表达TLR5;MTT法测K562细胞增殖,不同浓度的CBLB502对K562细胞的增殖没有明显影响;在10 Gyγ射线照射和化疗药物阿糖胞苷对K562细胞处理前加入CBLB502(终浓度为200 ng/ml),结果表明CBLB502不影响γ射线照射及阿糖胞苷对K562细胞的杀伤效果。裸鼠皮下接种K562细胞后,肿瘤周围注射CBLB502或PBS,连续14天测量肿瘤体积和重量。CBLB502从注射后第6天起肿瘤体积明显小于PBS组(p<0.05);CBLB502注射后第14天肿瘤重量显著小于PBS组(175.83±17.32 mg vs 273.52±24.08 mg,p<0.01)。我们进行了骨髓移植-重建试验。在CD45.2+小鼠进行8.5Gy全身照射,清髓前腹腔注射CBLB502。清髓后12小时尾静脉注射CD45.1+小鼠骨髓细胞,一个月后流式检查骨髓细胞重建率,CBLB502与正常对照组之间没有显著差异。表明CBLB502对骨髓移植无影响。综上所述,CBLB502能明显提高辐照后精子的数量和活动度,减少精子畸形,保护睾丸组织结构完整,提高小鼠的生育能力,降低遗传毒性。CBLB502增强抗氧化酶SOD活性,降低MDA,上调PCNA,促进DNA损伤修复。这种保护作用主要通过TLR5依赖途径激活NF-κB通路减轻炎症并抑制p53依赖性凋亡,下调Bax,上调Bcl-2。在白血病治疗应用上,CBLB502特异性保护骨髓造血系统促进细胞分化,但不保护白血病细胞,不影响白血病细胞放化疗敏感性、不影响骨髓移植,并抑制K562细胞在体内生长。