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高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography,简称HSCCC)是一种新型的利用液-液分配原理进行分离的一种色谱技术。其不使用固体作为载体,避免了固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等不利现象。可以粗品直接进样,可以实现分离纯化与制备同步完成。目前高速逆流色谱已广泛的运用于天然产物、海洋活性成分、无机物、抗生素等物质的分离纯化中。蜂毒是工蜂用其螯针刺敌时分泌的一种毒汁,其成分十分复杂,主要为肽类、酶类及非肽类物质。其中蜂毒肽是蜂毒主要组成成分及活性成分,是一种含有26个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。其能抗炎、镇痛、抑制血小板凝集。但由于蜂毒中成分复杂且多呈碱性,因此从粗蜂毒中纯化蜂毒肽比较困难。目前国内外多采用多步层析的方法制备纯化蜂毒肽,其过程繁琐,成本高,所得制品需要样品前处理及后续处理。本文采用高速逆流色谱方法,建立一种新的分离蜂毒肽方法,鉴定了所得产物的分子量及氨基酸一级结构,证明分离所得物质为蜂毒肽。此方法降低了成本,样品无需前处理,所得产物不需后续处理,增加了一次分离量。根据蜂毒肽的极性及理化性质,参考国内外溶剂体系比例组成,选择了多种溶剂体系进行初步选择,最后总结了五种可参考数据的溶剂体系:正己烷/甲醇/水、正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水、苯/乙酸乙酯/甲醇/水、氯仿/甲醇/水,氯仿/甲醇/水(醋酸)。比对了这五种体系的不同比例组合的K值和分层时间后,选择了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水体系的1/1/1/1(v/v)、1/6/1.5/7.5(v/v)及3/7/5/5(v/v)三种比例组份体系;苯/乙酸乙酯/甲醇/水的1/1/1/1(v/v)体系;氯仿/甲醇/水的1/1/1/1(v/v/v)及4/3/2(v/v/v)体系;以及氯仿/甲醇/水(醋酸0.2mol/L)的1/1/1(v/v/v)及4/3/2(v/v/v)体系。考察这些体系的固定相保留率、HSCCC平衡时间及是否出峰,保留了正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水的3/7/5/5(v/v)体系。对此体系进行分离条件优化,得到最佳分离条件:HSCCC螺旋管转数为850rmp、流动相流速为1mL/min及循环水浴温度为25℃。最后对HSCCC分离产物进行分子量测定,所得分析量为2845,并根据一级结构的鉴定得知所得分离产物为蜂毒肽。