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目前普遍认为,苯的代谢产物,而不是苯自身,介导了苯对造血细胞的多种生物学作用,产生骨髓毒性。苯的醌类代谢产物—氢醌暴露可诱导细胞损伤和细胞凋亡。近来研究表明,DNA-PKcs是一个重要的损伤修复基因,在DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)、V(D)J重组和维持端粒结构等方面起关键作用,参与转录及细胞凋亡等过程；同时,还参与肿瘤细胞的放疗和化疗耐受性。Akt在调节细胞生长、增值、凋亡、代谢和细胞迁移等方面发挥重要作用。但是,关于DNA-PKcs/Akt信号通路是否在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中发挥作用,目前还没有报道。本研究将探讨DNA-PKcs/Akt及其下游信号通路在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用及其机制。第一部分ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用目的：探讨ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路的活化在氢醌诱导的人慢性白血病细胞(human chronic leukemia cells)K562损伤和细胞凋亡中的作用。方法：运用CCK-8法检测细胞增殖情况；利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone,HQ)诱导K562细胞凋亡情况；运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE,利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况；用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达；Real-time PCR检测DNA-PKcs和Aktl的mRNA表达；采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法测定DNA-PKcs、Akt和P-Akt (phospho-Akt Ser473)蛋白表达情况。结果：CCK-8法实验结果表明,氢醌对K562细胞的生长有很强的抑制作用,呈剂量-反应和时间-反应关系。流式细胞仪检测表明,在氢醌诱导的细胞损伤和凋亡中,0-50μM时,随着剂量的加大,ROS的产生和细胞凋亡率也增加,都存在剂量-反应关系；两者之间存在正相关关系；100μM时,ROS的产生下降,细胞凋亡率最高。将50gM氢醌处理K562细胞不同的时间(0、3、6、12和24h),0-12h时,随着作用时间的延长,DCF的荧光强度逐渐增加,存在时间-反应关系；处理24h时,ROS的产生明显减少。实时定量PCR和Western Blotting检测显示,0-100μM时,DNA-PKcs和Akt1的基因表达均随氢醌剂量的加大而增加,DNA-PKcs和P-Akt的蛋白表达也随氢醌剂量的加大而增加,都存在剂量-反应关系,然而,Akt的蛋白表达没有变化。结论：本研究结果显示,氢醌诱导ROS的产生和DNA-PKcs/Akt信号通路,与K562细胞损伤和凋亡有相关性。第二部分NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路增强氢醌诱导的K562细胞凋亡目的：探讨NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路,对氢醌诱导K562细胞凋亡的作用。方法：运用细胞直接计数法检测细胞增殖情况；利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone, HQ)诱导K562细胞凋亡情况；运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE,利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况；用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达；Real-timePCR检测DNA-PKcs和Akt的mRNA表达；采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)万法测定相关蛋白,包括信号通路中相关激酶DNA-PKcs、Akt、P-Akt(phospho-Akt Ser473)、Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达情况。结果：我们采用DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)特异的抑制剂NU7026与不同浓度(0、10、25、50和100μM)氢醌(Hydroquinone,HQ)共同处理K562细胞,研究氢醌导致细胞凋亡的作用,以及调控的信号通路。细胞直接计数实验证明,预先用NU7026孵育K562细胞1h,采用不同浓度氢醌(0、10、25、50和100μM)处理K562细胞24h后,NU7026对DNA-PKcs的抑制可显著增强氢醌对K562细胞的毒性作用,抑制细胞的活性,并存在剂量-反应关系。NU7026与不同浓度氢醌(0、25、50和100μM)共同处理K562细胞24h后,诱导细胞凋亡率增加。NU7026与氢醌联合作用,不影响活性氧的产生和氢醌的氧化应激,但导致DNA-PKcs基因水平和蛋白水平的表达下降。此外,氢醌增加Akt的磷酸化,使Akt活化；最后,它与NU7026联合作用阻止了Akt的活化,增加促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白的表达,但降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达。该结果揭示了DNA-PKcs在氢醌血液毒性中的核心作用,它负责参与DNA双链断裂修复、细胞周期的进行和细胞凋亡的调节,以应对氢醌引起的K562细胞DNA损伤和细胞凋亡。结论：NU7026增强了氢醌诱导人慢性白血病细胞K562的细胞凋亡,通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路,导致其下游蛋白Bcl-2下调,以及Bax和caspase3上调。