研究背景和目的肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury, LIRI)是一类严重影响人类健康而又难以避免的并发症,常见于肺移植、体外循环、肺袖式切除术、肺动脉成形术、心脏手术、肺动脉血栓内膜剥脱术、心肺复苏等情况。再灌注是一把双刃剑,既是恢复和维持缺血区肺功能所必须,同时又诱发一系列复杂的级联反应,导致肺损伤。肺缺血再灌注损伤的发生发展是一个复杂的、多因素的病理生理过程,常涉及炎症、氧化应激、白细胞活化、细胞内钙超载、自由基产生、促炎介质释放、细胞表面膜分子上调、蛋白酶释放、及保护性介质如肺泡表面活性物质减少等。临床上,常特征性表现为肺水肿、肺动脉高压、肺血管阻力增加、及肺血管通透性增加。不幸的是,肺缺血再灌注损伤所导致的严重后果并不局限于肺部。很多情况下,局部炎症反应可诱发全身系统性炎症反应并导致多器官功能障碍,甚至引起死亡。然而,目前对于肺缺血再灌注损伤的预防或治疗仍缺乏行之有效的药物和方法。因此,迫切需要对肺缺血再灌注损伤的病理生理机制进行深入研究,以探讨新的预防和治疗策略。血管内皮细胞是肺缺血再灌注损伤的重要介质。缺血可激活NF-κB、NADPH、钙调蛋白依赖性一氧化氮合酶(nitric oxygen synthase, NOS),增加促炎细胞因子水平,使内皮细胞产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加,并上调细胞表面膜分子。上述变化直接或间接作用于微循环系统,引起肺血管阻力增加和微血管通透性增强,导致再灌注后肺水肿,引起通气血流比例失调,导致氧合功能异常加重缺氧。在肺缺血再灌注损伤的早期,内皮细胞主要表现为凋亡,而非坏死。细胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450epoxygenase, CYP)是一个巨大的氧化酶超家族,包括2C和2J两类。目前已知6种克隆的2J,而在人体内仅发现了2J2。CYP2J2在血管内皮细胞和心肌细胞中高表达,在肝脏、肾脏等组织中也有分布。CYP2J2可以代谢花生四烯酸生成4种同源异构的环氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs),包括5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET。既往的研究表明,在正常以及病理生理条件下,EETs可以发挥多种生物学效应,包括抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗纤维化等。而且,越来越来的证据表明,EETs能够减轻器官的缺血再灌注损伤。比如,EETs通过增加局部脑血流和抑制凋亡,减轻CYP2J2转基因小鼠的脑缺血再灌注损伤；通过改善心功能、减少缺血再灌注后心梗面积,保护心肌组织。此外,用11,12-EET预处理肺动脉可以降低caspase-3的活性。尽管具体机制不明确,EETs被证实可以显著降低缺血再灌注后的离体大鼠肺血管内皮细胞的通透性。基于以上结论,我们提出这样的假设,通过在体内过表达CYP2J2基因,增加内源性EETs的表达,并通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等机制,减轻肺的缺血再灌注损伤。因此,在本研究中,我们首先通过转基因在大鼠体内过表达CYP2J2,并成功构建大鼠的肺缺血再灌注损伤模型,观察CYP2J2基因过表达在大鼠的肺缺血再灌注损伤模型中的作用及其可能的分子机制,并进一步在体外实验中探讨了CYP2J2基因过表达和外源性EETs预处理对缺氧复氧模型中肺动脉内皮细胞的作用及可能的信号通路,旨在从动物整体水平和细胞水平进一步明确肺缺血再灌注损伤的机制,并阐明CYP2J2-EETs系统在肺的缺血再灌注损伤中的作用及其相关的信号通路,为肺缺血再灌注损伤的预防和治疗提供新的理论依据和实验基础。一、CYP2J2基因过表达及外源性EETs通过抑制炎症减轻肺的缺血再灌注损伤实验方法：(一)体内实验1.携带目的基因CYP2J2及对照基因GFP的pcDNA3.1-CYP2J2和pcDNA3.1-GFP质粒的提取和纯化。2.实验动物的分组及处理：50只健康雄性Wistar大鼠,体重280-350g,适应性喂养1周后,随机分为5组,每组10只,分别为：空白对照组(Blank).单纯开胸组(Sham).肺缺血再灌注损伤组(IR)、肺缺血再灌注+pcDNA3.1-GFP基因转染组(IR+GFP)、肺缺血再灌注+pcDNA3.1-CYP2J2基因转染组(IR+CYP2J2)。术前2周,按3mg/kg体重,：R+GFP和IR+CYP2J2组的大鼠分别通过尾静脉注射携带相应基因的质粒,每周1次,连续2周。其它组大鼠同期通过尾静脉注射相应体积生理盐水。3.肺缺血再灌注损伤模型的构建：第2次注射1周后,来自IR、IR+GFP、IR+CYP2J2组的大鼠接受经第5肋间的左前外侧开胸手术。首先,按1O00IU/kg体重,向右心室注射肝素钠预防血栓形成。5分钟后,分离左肺门并用无创性动脉夹阻断,包括左主支气管、左肺动脉和左肺静脉,通过阻断通气和血流造成左肺完全缺血缺氧。1小时后,松开动脉夹,左肺恢复通气和血流灌注2小时。来自单纯开胸组的大鼠同样接受左前外侧开胸手术,但不执行肺缺血再灌注损伤的操作,观察3小时。而空白对照组的大鼠不接受任何手术。整个手术操作过程是在全麻和气管插管、呼吸机辅助呼吸下完成的。整个过程中,将动物置于温床并用烤灯保持温暖,手术切口用温的生理盐水湿纱布覆盖以防止体液丢失。造模结束后,处死动物,留取肺组织、血液及尿液标本。4.用Western blot方法检测各组大鼠肺组织中CYP2J2的蛋白表达,ELISA方法检测各组大鼠血浆和肺组织14,15-DHET浓度。5.检测左肺湿干重比及肺与体重比。6.检测支气管肺泡灌洗液蛋白浓度。7.肉眼观察缺血再灌注后左肺大体标本的变化及镜下观察HE染色病理组织学变化。8.用ELISA法检测大鼠血浆中IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α,可溶性P-选择素(soluble P-selectin, sP-selectin)及可溶性E-选择素(soluble E-selectin, sE-selectin)的水平。9.Western blot方法检测大鼠肺组织中IκBα, NF-κB p65和PPARy的蛋白表达水平。(二)体外实验10.人肺动脉内皮细胞的培养、基因转染及转染效率评估：用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基培养人肺动脉内皮细胞(HPAECs),置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱。当细胞生长至单层密度约90%时,传代至6孔板。当6孔板内细胞密度达到60%时,用Fugene HD转染试剂将pcDNA3.1-CYP2J2和pcDNA3.1-GFP质粒转染至细胞内。48-72小时后,用荧光显微镜及流式细胞仪检测其转染效率,用Western blot检测转染后细胞内CYP2J2蛋白表达。11. HPAECs的分组及体外缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation, HR)模型的构建：分组：根据CYP2J2基因转染或外源性EETs的干预分别分成7组,前者包括：对照组(Control组)、pcDNA3.1-GFP组(GFP组)、pcDNA3.1-CYP2J2组(CYP2J2组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧复氧+pcDNA3.1-GFP组(HR+GFP组)、缺氧复氧+pcDNA3.1-2J2组(HR+CYP2J2组)、缺氧复氧+pcDNA3.1-2J2+GW9662组(HR+CYP2J2+GW9662组)；后者包括：对照组(Control组)、溶媒组(DMSO组)、EET组、缺氧复氧组(HR组)、缺氧复氧+溶媒组(HR+DMSO组)、缺氧复氧+EET组(HR+EET组)、缺氧复氧+EET组+GW9662组(HR+EET+GW9662组)。其中GW9662为PPARγ抑制剂。HR模型的构建：当6孔板内细胞密度达80%后,用PPARγ抑制剂GW9662(lumol/L)预处理30分钟,然后向培养基中加入EET(lumol/L)或DMSO。1小时后,更换无糖无血清细胞培养基,置于缺氧培养箱培养(5%CO2,95%N2,37℃)。8小时后更换回完全细胞培养基,置于正常培养箱(5%CO2,95%air)复氧培养16个小时。而对照组细胞在正常培养箱中培养24小时,不进行缺氧复氧培养。而对于CYP2J2转基因组,当6孔板内细胞密度达60%后进行基因转染,48小时后加入GW9662,其余处理与上述一致。12.ELISA法检测细胞培养基中IL-1β,IL-6,IL-10,细胞间粘附因子-1(intracellular adhesion molecular-1, ICAM-1)和血管内皮黏附分子-1(vascular endothelial adhesionmolecular-1, VCAM-1)的水平。13.Western blot方法检测HPAEC中IκBα, NF-κB p65和PPARy的蛋白表达水平。实验结果1.荧光显微镜观察及流式细胞仪检测显示pcDNA3.1质粒可有效将pcDNA3.1-CYP2J2转染至人肺动脉内皮细胞内,其转染效率可达60%。2.CYP2J2基因转染显著提高了肺组织及人肺动脉内皮细胞CYP2J2蛋白表达水平,和体循环中内源性EET水平。3.CYP2J2基因过表达对左肺湿干重比及肺体重比的影响：IR+CYP2J2组的左肺湿干重比值明显低于IR组及IR+GFP组,但三组均明显高于Blank组和Sham组(P<0.05)。而Blank组与Sham组、R组与IR+GFP组之间比较无显著统计学差异(P>0.05)。IR+CYP2J2组的肺体重比值明显低于IR组及IR+GFP组,但三组均明显高于Blank组和Sham组(p<0.05)。而Blank组与Sham组、IR组与IR+GFP组之间比较无显著统计学差异(p>0.05)。4.CYP2J2基因过表达对支气管肺泡灌洗液蛋白浓度的影响：IR+CYP2J2组的左肺支气管肺泡灌洗液总蛋白浓度显著低于IR组及IR+GFP组,但三组均显著高于Blank组和Sham组(p<0.05)。5.CYP2J2过表达对肺大体外观及组织病理学的影响：大鼠左肺组织大体外观显示：IR组及IR+GFP组左肺充血、水肿明显,IR+CYP2J2组与之相比明显减轻,而Blank组及Sham组左肺外观基本正常,无明显充血、水肿。光镜下,大鼠左肺组织HE染色组织病理学显示：Blank组及Sham组左肺组织结构正常,无明显炎症细胞浸润；IR组及IR+GFP组左肺间质及血管周围明显水肿,肺间质及肺泡腔炎症细胞浸润,肺胞内可见纤维素沉积和出血,由于水肿、红细胞渗出及纤维素沉积,肺泡间隔明显增宽,提示肺缺血再灌注损伤造模成功；而CYP2J2基因过表达显著减轻了肺水肿和炎症细胞浸润。肺组织损伤评分进一步证实了CYP2J2对于肺缺血再灌注损伤的保护作用。6.CYP2J2基因过表达对大鼠血浆炎症介质及炎症相关蛋白的影响：我们用ELISA方法检测了大鼠血浆中IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、sP-selectin及sE-selectin,结果显示：在IR组及IR+GFP组,IL-1β、IL-8、TNF-α、sP-selectin及sE-selectin的水平显著高于Blank组及Sham组,而CYP2J2基因转染明显抑制了肺缺血再灌注损伤后上述促炎因子的升高(p<0.05)；同时,与IR组及IR+GFP组相比,CYP2J2过表达显著促进了大鼠血浆中抗炎细胞因子IL-10的表达增加,但仍明显低于Blank组和Sham组(p<0.05)。我们同时用Western blot方法检测了大鼠肺组织细胞浆PPARγ、IκBα和细胞核NF-κB p65的水平,结果显示：与Blank组及Sham组相比,IR组及IR+GFP组大鼠肺组织细胞浆PPARγ、IκBα水平明显降低,而CYP2J2过表达则显著抑制了肺缺血再灌注损伤后这两种蛋白表达水平的下降(p<0.05)；相反,与Blank组及Sham组相比,IR组及IR+GFP组大鼠肺组织细胞核NF-κB p65的水平明显升高,而CYP2J2过表达则显著抑制了这种变化(p<0.05)。7.CYP2J2基因过表达及外源性11,12-EET对缺氧复氧后HPAECs的抗炎效应及其机制：ELISA检测发现,与Control、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组的IL-1β和IL-6水平明显升高,而CYP2J2基因过表达显著抑制其升高水平,GW9662则明显阻断了CYP2J2的作用(p<0.05)。相反地,与Control、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组的IL-10水平显著降低,CYP2J2过表达显著抑制其下降水平,而GW9662明显阻断了CYP2J2的作用(p<0.05)。然而,尽管与常氧组相比VCAM-1和ICAM-1的水平显著升高,但在各HR组间无明显差异(p>0.05)。Western blot检测进一步发现,与Control、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组中细胞浆PPARγ及IκBα表达明显下降,而CYP2J2基因过表达或外源性11,12-EET显著抑制其下降水平,GW9662则部分阻断其保护作用(p<0.05)。此外,HR、HR+GFP组中细胞核中NF-κBp65较常氧组显著升高,而CYP2J2过表达及11,12-EET显著抑制其升高水平,这种保护作用可被GW9662阻断(p<0.05)。二、CYP2J2基因过表达及外源性EETs通过抑制氧化应激和凋亡减轻肺的缺血再灌注损伤实验方法(一)体内实验1.实验动物的分组及处理：参照第一部分。2.Wistar大鼠肺缺血再灌注损伤模型的构建：参照第一部分。3.肺组织切片TUNEL染色镜下观察细胞凋亡：每组随机观察5张切片,每张切片观察5个高倍镜视野,TUNEL染色阳性者提示细胞凋亡,计算凋亡指数,即凋亡细胞数占总细胞数的比例。4.Western blot法检测大鼠肺组织中氧化应激相关蛋白SOD1, SOD2, catalase, gp91,p47和p67的表达。(二)体外实验5.人肺动脉内皮细胞(HPAECs)的培养和基因转染：参照第一部分。6. HPAECs缺氧复氧模型的构建：参照第一部分。7.用CCK8法检测外源性EETs对细胞增殖的影响：将细胞传至96孔板,首先观察不同缺氧复氧模型对细胞增殖的影响,分别为缺氧2小时复氧4小时(H2R4)、缺氧4小时复氧8小时(H4R8)、缺氧8小时复氧16小时(H8R16),分别于0.5、1、2、4个小时分别用紫外分光光度计测定吸光度进行评估；然后在常氧下,分别用8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET干预HPAECs,于加药后0.5、1、2、4个小时测定吸光度,评估不同EET对常氧培养下细胞增殖的影响；最后观察3种EET对缺氧复氧模型细胞增殖的影响。8.用荧光显微镜和流式细胞仪检测CYP2J2基因过表达及外源性EETs对缺氧复氧培养后细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的影响。9.用流式细胞仪检测CYP2J2基因过表达及外源性EETs对缺氧复氧培养后细胞线粒体膜电位的影响：JC-1是线粒体膜电位特异性敏感的荧光探针,用于检测线粒体膜电位。正常状态下,线粒体膜电位高,JC-1聚集在线粒体基质形成聚合物(J-aggregates),发出橙红色荧光；当细胞损伤出现早期凋亡时,线粒体膜电位下降,JC-1形成单体(monomer)并发出绿色荧光。根据橙红色荧光与绿色荧光的比值,我们可以判断线粒体膜电位的损伤程度。10.流式细胞仪检测CYP2J2基因过表达及外源性EETs对缺氧复氧培养后细胞凋亡的影响。11.Western blot法检测细胞中P13K,磷酸化Thr308-Akt, Bcl-2, Bcl-xl, Bax, SOD1, SOD2, catalase, p67-phox, gp91-phox, p47-phox, caspase-3的蛋白表达。实验结果1.CYP2J2过表达对缺血再灌注后大鼠肺组织氧化应激的影响：Western blot结果显示,与Blank组及Sham组相比,IR组和IR+GFP的gp91、p47、p67表达显著升高,CYP2J2过表达则明显抑制其升高水平；相反,IR组和IR+GFP组的SOD1、SOD2和catalase蛋白表达水平明显低于Blank组及Sham组,CYP2J2过表达则显著抑制其下降水平。2. CYP2J2过表达对缺血再灌注后大鼠肺组织凋亡的影响：TUNEL染色显示,与Blank组(0.0184±0.007412)及Sham组(0.023±0.007674)相比,IR组(0.202875±0.05523)和IR+GFP(0.201625±0.037067)组的凋亡指数显著增加,而CYP2J2过表达则显著抑制了缺血再灌注后凋亡指数的增加水平(p<0.05)。3.外源性EETs对细胞增殖的影响：CCK8法检测结果显示,不同的缺氧复氧模型对细胞活力有影响,与对照组相比,H8R16模型能引起细胞活力显著下降(p<0.05),而H2R4、H4R8模型无明显影响(p>0.05)；而在常氧条件下,3种EET对细胞活力均无明显影响(p>0.05)；在H8R16条件下,与H8R16组和H8R16+DMSO组相比,加入外源性11,12-EET和14,15-EET能显著促进细胞增殖(p<0.05),而8,9-EET效果不明显(p>0.05)。4.外源性EETs及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞内ROS的影响：流式细胞仪检测结果显示,与Contro1、DMSO及3种EET组相比,HR及HR+DMSO组的ROS水平显著升高,而8,9-EET、11,12-EET及14,15-EET显著抑制了缺氧复氧后ROS的升高水平,14,15-EEZE(EETs的选择性抑制剂)则明显阻断了EETs的作用p<0.05)；类似的,与Contro1、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组的ROS水平明显升高,而CYP2J2过表达显著抑制缺氧复氧后ROS的升高水平,14,15-EEZE则阻断了CYP2J2的保护作用(p<0.05)。荧光显微镜观察进一步证实了上述效应。5.外源性EETs及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞凋亡的影响：流式细胞检测结果显示,与Contrl、DMSO及3种EET组相比,HR及HR+DMSO组的细胞凋亡比例明显增加,而8,9-EET、11,12-EET及14,15-EET显著抑制了缺氧复氧后细胞凋亡的升高水平,LY294002(PI3K非特异性抑制剂)及14,15-EEZE则阻断了EETs的保护作用(p<0.05)；相似的,与Control、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组的细胞凋亡比例明显升高,而CYP2J2过表达显著抑制缺氧复氧后细胞凋亡的升高水平,LY294002及14,15-EEZE则阻断了CYP2J2的保护作用(p<0.05)。6.外源性EETs及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞线粒体膜电位的影响：流式细胞仪检测结果显示,与Control、DMSO及14,15-EET组相比,HR及HR+DMSO组的JC-1聚合物/单体比值显著降低,而14,15-EET显著抑制了缺氧复氧后JC-1聚合物/单体比值的下降,这种保护作用被LY294002及14,15-EEZE阻断(p<0.05)；类似的,与Control、GFP及CYP2J2组相比,HR、HR+GFP组的JC-1聚合物/单体比值显著下降,而CYP2J2过表达显著抑制其下降水平,LY294002及14,15-EEZE则明显阻断了CYP2J2的作用(p<0.05)。7.外源性14,15-EET及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞氧化应激相关蛋白表达的影响：Western blot结果显示,14,15-EET及CYP2J2过表达显著抑制了缺氧复氧后gp91(跨膜蛋白)、p47、p67和NOX4蛋白的升高水平,而LY294002则阻断了14,15-EET及CYP2J2的作用(p<0.05)：相反,与常氧组相比,缺氧复氧处理后细胞SOD1、SOD2及catalase的蛋白表达水平显著降低,而14,15-EET及CYP2J2过表达显著抑制其降低水平,这种保护作用可被LY294002阻断(p<0.05)。8.外源性14,15-EET及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞凋亡相关蛋白表达的影响：Western blot结果显示,与常氧组相比,缺氧复氧后细胞的Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达水平显著降低,而14,15-EET及CYP2J2过表达显著抑制其下降水平,LY294002阻断了14,15-EET及CYP2J2过表达的保护作用(p<0.05)；相反,与常氧组相比,缺氧复氧后细胞的Bax、caspase-3蛋白表达水平升高,而14,15-EET及CYP2J2过表达显著抑制其升高水平,这种作用可被LY294002阻断(p<0.05)。9.外源性14,15-EET及CYP2J2过表达对缺氧复氧后细胞PI3K/Akt通路蛋白表达的影响：Western blot检测结果显示,与常氧组相比,缺氧复氧能够显著抑制P13K及P13K依赖性Akt蛋白的磷酸化,外源性14,15-EET及CYP2J2过表达可以显著改善这种抑制水平,而LY294002可阻断14,15-EET及CYP2J2过表达的作用(p<0.05)。统计学分析采用SPSS15.0软件进行统计学分析,所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示,组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行比较,p<0.05为差异具有统计学意义。结论1.CYP2J2基因可在Wistar大鼠肺组织及HPAECs中稳定转染,增加CYP2J2蛋白表达,并提高血循环EETs的水平。2.CYP2J2过表达能显著减轻肺缺血再灌注导致的肺水肿和炎症细胞浸润。3.CYP2J2过表达可显著减轻大鼠肺缺血再灌注后炎症反应,包括抑制促炎介质的释放、抑制NF-κBp65核转位。4.CYP2J2过表达可显著抑制大鼠肺缺血再灌注后氧化应激水平。5.CYP2J2过表达可显著改善大鼠肺缺血再灌注后细胞凋亡。6.CYP2J2过表达或外源性EETs可显著改善HPAECs缺氧复氧后炎症水平,包括抑制促炎细胞因子的释放和NF-κBp65核转位,其抗炎作用可能是通过PPARγ活化来介导的。7.CYP2J2过表达及外源性EETs可显著改善HPAECs缺氧复氧后氧化应激水平,包括抑制ROS的产生、抑制NADPH氧化酶的活性及促进抗氧化蛋白的表达。8.CYP2J2过表达及外源性EETs可显著改善HPAECs缺氧复氧后凋亡水平,包括抑制线粒体膜电位的损伤、细胞凋亡及调节凋亡相关蛋白的表达,其抗凋亡作用可能是通过PI3K/Akt通路的激活来介导。总之,CYP2J2基因过表达及外源性EETs可以通过抗炎、抗氧化应激及抗凋亡来减轻肺的缺血再灌注损伤,起保护作用可能与PPARy及PI3K/Akt通路的激活有关。