论文部分内容阅读
研究目的癫痫是一种多病因脑功能障碍综合症,随着相关研究不断发展,普遍认为癫痫的发作与群体神经细胞异常的同步放电有关。本研究基于癫痫发生的钙假说,利用多通道光纤光度测定方法(Multi-channel fiber photometry),在腹腔注射海人酸(Kainic acid,KA)诱导自由活动小鼠急性痫样发作前后,同步记录海马(Hippocampus)CA1区和初级运动皮层(Primary motor cortex)M1区出现的钙信号,分析两个脑区的钙活动特征及其与小鼠行为学表现的关联,并研究在海马CA1区局部光解笼抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的光敏复合物Rubi-GABA,对初级运动皮层M1区痫样钙信号和小鼠行为学发作严重程度的影响。研究内容1.麻醉状态海马CA1区和初级运动皮层M1区钙信号的同步记录及特征分析;2.清醒自由活动状态和腹腔注射KA诱发急性痫样发作状态,海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号同步记录及特征分析;3.在海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA对初级运动皮层M1区痫样钙信号和小鼠行为学发作严重程度的影响。研究方法1.实验对象和分组:选用SPF(Specific pathogen free)级别8~12周的雄性C57BL/6小鼠为研究对象。观察KA诱发痫样发作部分,实验分为腹腔注射生理盐水对照组和腹腔注射10mg/kg剂量KA实验组;海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA部分,实验分为生理盐水+光照对照组和Rubi-GABA+光照实验组;2.急性痫样发作建模和行为学评价:腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液诱发急性痫样发作。对小鼠给药前10min和给药后1.5h的行为学表现进行视频录制(与钙信号同步记录),按照改进的Racine分级法则对小鼠痫样发作行为评级,出现Ⅰ级以上发作则认为诱发发作成功,将Ⅲ级以上统称为惊厥性运动发作(Convulsive motor seizure,CMS);3.钙信号记录:实验小鼠进行开颅手术后在其海马CA1区和初级运动皮层M1区注射加载钙离子指示剂Cal-520 AM,并在其上方植入记录光纤收集信号;4.光解笼Rubi-GABA:实验小鼠进行开颅手术后在其海马CA1区注射Rubi-GABA,并在其上方植入光纤用于局部光解笼。参与局部光解笼所需激发光的耦合光路的搭建,用于光解笼的光纤端面的输出功率调整为15m W;5.钙信号分析与统计:采用基于MATLAB编写的Op Signal多通道分析软件对钙信号进行读取和分析,其中钙活动的幅值用△F/F表示;用Clampfit 10.6统计钙活动的幅值、频率和持续时间;用Graphpad Prism7进行配对样本的非参数检验。研究结果1.麻醉和清醒状态下同步记录海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号:a)异氟烷/氧气体积分数为1.2%的条件下,CA1区钙信号的幅值为1.54±0.35%△F/F,频率为0.10±0.005Hz,M1区钙信号的幅值为1.76±0.29%△F/F,频率为0.14±0.03Hz;b)异氟烷/氧气体积分数为0.8%的条件下,CA1区钙信号的幅值为0.78±0.17%△F/F,频率为0.20±0.02Hz,M1区钙信号的幅值为1.16±0.14%△F/F,频率为0.38±0.04Hz;c)清醒自由活动条件下,CA1区钙信号的幅值为0.92±0.20%△F/F,频率为0.32±0.06Hz;M1区钙信号的幅值为1.05±0.17%△F/F,频率为0.35±0.04Hz。2.急性痫样发作状态下同步记录海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号:a)海马CA1区的钙信号表现为两种大类型,一种是基线升高且具有较长持续时间式钙波,另一种是基线平稳的簇状高频脉冲式钙波。第一种类型的钙波又分为两小类,第一种由钙积聚(build-up)和特征类似于皮层扩布抑制(Cortical spreading depression,CSD)的大波组成,这种CSD样钙波的幅值最大,为42.64±9.74%△F/F,持续时间最长,为216.50±26.25s;第二种单独出现的非CSD样钙波的幅值为15.18±3.29%△F/F,持续时间为70.75±12.47s。基线平稳的簇状高频脉冲式钙波的幅值为9.83±2.64%△F/F。b)初级运动皮层M1区的钙信号仅表现为基线升高且具有较长持续时间式钙波,和海马CA1区痫样钙信号相似,其中也分为两个小类,CSD样钙波幅值为32.79±4.55%△F/F,持续时间为333.50±66.65s;非CSD样钙波幅值为4.08±0.91%△F/F,持续时间为92.50±21.75s。3.海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA对初级运动皮层M1痫样钙信号的影响:在初级运动皮层M1区出现痫样钙信号时在海马CA1区进行持续时间为30s的光照,观察到初级运动皮层M1区痫样钙信号“变形”,即明显幅值上升和出现高频震荡脉冲波形,与生理盐水对照组有明显区别,且对钙波出现伴随的行为学发作有加重效果。结论1.麻醉状态下,海马CA1区和初级运动皮层M1区的钙信号具有一定的同步性,且其幅值和频率具有麻醉浓度依赖性,麻醉浓度越大,钙信号频率越低,幅值越大。不同麻醉浓度下分别具有统计学差异。2.腹腔注射KA诱发急性痫样发作状态下,海马CA1区和初级运动皮层M1区中,基线抬升且具有一定持续时长式的钙波出现时具有一定的同步性,特别是非CSD样钙活动;CSD样钙活动在两个脑区均各自出现,且在CA1区出现的次数均高于M1;簇状高频脉冲式钙波则仅出现在海马CA1区。不同种类的钙信号的出现与行为学表现有一定的对应关系。3.在海马CA1区局部光解笼Rubi-GABA会出现对初级运动皮层M1区痫样钙活动和行为学发作有加重其异常和无效的结果。