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研究目的:女性宫颈癌的发生率与性生活频率密切相关;以往研究显示,精浆能促进宫颈癌的发生,但是发生机制尚不明确。端粒酶在细胞永生化和恶性转化的过程中发挥了重要的作用。本研究拟探讨精浆对人宫颈癌细胞系及正常宫颈上皮细胞中端粒酶,尤其是端粒酶的关键成分人端粒酶逆转录酶(hTERT)的调控作用及机制。研究方法:(1)细胞培养与处理:人宫颈癌细胞系HeLa、Caski和SiHa,以及从人正常宫颈组织中分离的宫颈上皮细胞在含10%胎牛血清和抗生素(100U/ml青霉素和链霉素)的RPM11640培养基中培养,至对数生长期后进行如下处理:四种细胞均进行血清饥饿处理,即细胞无血清培养48h,然后加入精浆,使精浆终浓度分别为1:50(宫颈癌细胞系)和1:10(正常宫颈上皮细胞)。精浆与细胞共孵育48h后,收获细胞,分别应用端粒酶活性检测试剂盒(Telomeric RepeatAmplification Protocol)和Real-time PCR技术检测端粒酶活性及hTERT mRNA表达水平。(2)siRNA技术:应用特异性环氧化酶-2(COX-2)的小干扰RNA(siRNA)抑制HeLa细胞中COX-2的表达,然后加入精浆至终浓度1:50(方法同上),共孵育48小时后应用Real-time PCR技术测定hTERT mRNA,COX-2 mRNA及c-myc mRNA的表达水平。同时应用Western blot方法检测COX-2 siRNA的抑制效果以及精浆对HeLa细胞中COX-2蛋白水平的影响。(3)荧光素酶活性测定:将含有hTERT核心启动子序列的启动子转录活性报告质粒p181转染入HeLa细胞中,加入精浆处理至终浓度1:50,然后用双荧光素酶报告测试系统测定荧光素强度。研究结果:在上述用精浆处理的三株细胞系中,hTERT mRNA表达及端粒酶活性明显上调;正常宫颈上皮细胞只表达微量的hTERT mRNA并低度表达端粒酶活性,但是精浆能显著地提高hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性;在精浆处理过的HeLa细胞系中,COX-2表达水平显著上调;COX-2被siRNA抑制后,精浆对hTERT启动子活性、hTERT表达的诱导作用消失;同时,在精浆处理过的HeLa细胞系中,hTERT启动子转录活性的上调不依赖于hTERT的主要转录因子c-myc。结论及意义:在人宫颈癌细胞系及正常宫颈上皮细胞中,精浆通过上调hTERT的转录活性诱导hTERT mRNA表达及端粒酶活性。COX-2在这个过程中发挥了重要作用,且这一过程不依赖于c-myc。这些结果揭示了精浆在宫颈癌发生过程中可能的作用及机制,为进一步探讨性生活方式对宫颈癌发生的影响及其作用机制,以及端粒酶的表达调控机制提供了实验依据,具有重要的生物学和临床意义。