第一部分红景天苷对高糖环境下小鼠足细胞凋亡和氧化应激的影响目的:当前,中国糖尿病患者接近1亿,俨然成为糖尿病发病人口总量最大的国家。迫切需要更多有效的治疗措施问世以防止并发症的发生发展。糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管病变,也是导致终末期肾病和致死的主要原因之一。积极探索糖尿病肾病的发病机制并寻找有效干预措施,已成为当前肾脏病及内分泌领域热切关注的课题。迄今,糖尿病肾病的发病机制尚未明了。晚近研究显示,氧化应激反应在糖尿病发生发展过程中起重要作用,足细胞的损伤、凋亡与蛋白尿密切相关。中草药红景天,其主要有效成分红景天苷(Salidroside,SAL)具有抗衰老、抗缺氧、抗氧化等作用。有研究报道,红景天苷可提高糖尿病大鼠模型的抗氧化酶活性,抑制氧化应激反应,降低蛋白尿水平。本部分实验拟通过高糖环境体外培养的永生化小鼠足细胞,应用红景天苷进行干预,观察该药对足细胞氧化应激指标及凋亡情况的影响。方法:1培养条件性永生化小鼠足细胞,于倒置显微镜下观察足细胞形态变化,用足细胞特异性蛋白Synaptopodin荧光染色观察足细胞成熟情况。成熟的足细胞同步化后用于实验观察。2足细胞随机分为3组:正常糖组(NG,5.5mM,24h)、高糖组(HG,30mM,24h)、高糖+红景天苷组(HG 30mM+SAL 50μM,24 h)。以二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)为探针,采用流式细胞术,测定各组足细胞内活性氧ROS水平;应用噻唑蓝MTT比色法检测各组足细胞存活率;采用TUNEL试验检测细胞凋亡率;用免疫印迹(Western blot)方法检测足细胞凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3的表达。结果:1足细胞形态学观察:在33℃,γ-IFN存在的许可条件下培养的足细胞呈梭形或三角形,突起少。转入37℃无γ-IFN存在的非许可条件下培养10-14天,细胞停止增殖,胞浆向四周展开,从胞体伸出大量主突和次级足突,细胞呈“树枝状”形态。荧光染色可见分化成熟的足细胞表达足细胞特异性蛋白Synaptopodin。2 MTT比色法结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞的存活率较低;与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞存活率上升。差异均具有统计学意义(P<0.05)。3流式细胞术结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞总ROS含量更多;与高糖组相比,高糖+红景天苷组细胞总ROS含量较少。差异均具有统计学意义(P<0.05)。4 TUNEL法结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞凋亡率更高;与高糖组相比,高糖+红景天苷组细胞凋亡率较低。差异有统计学意义(P<0.05)。5 Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞Caspase-9、Caspase-3的表达水平较高;与高糖组相比,高糖+红景天苷组Caspase-9、Caspase-3的表达水平较低。差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1高糖环境可降低小鼠足细胞存活率,增加足细胞总ROS含量,并促进足细胞凋亡。2红景天苷可增加高糖环境下小鼠足细胞存活率,其机制可能与降低足细胞内氧化应激水平有关。3红景天苷可减少高糖环境下的小鼠足细胞凋亡,作用机制可能与通过降低凋亡相关蛋白的表达有关。第二部分红景天苷对高糖环境下小鼠足细胞HO-1、Nrf-2表达的影响目的:第一部分实验发现,红景天苷可抑制高糖培养下足细胞的氧化应激反应及凋亡,但其作用机制尚不清楚。血红素加氧酶(HO)是机体重要的抗氧化系统之一,包括三种亚型。其中HO-1是诱导型的血红素加氧酶,其诱导生成的多种产物能够发挥抗氧化作用。有研究表明,Nrf2/ARE通路是最重要的抗氧化应激通路,激活Nrf2可促进HO-1表达增多。本部分研究旨在通过体外培养的小鼠足细胞,探讨红景天苷是否能够通过调节足细胞内血红素加氧酶HO-1及Nrf2的表达发挥抗氧化应激、抗凋亡作用。方法:1培养条件性永生化小鼠足细胞,成熟足细胞同步化后用于实验观察。2分别于正常糖及高糖环境下培养的足细胞中加入不同浓度红景天苷(0、10、20、50μM,24h),用Western blot方法检测HO-1蛋白表达。根据实验结果选取最佳干预浓度。然后选用50μM红景天苷干预高糖培养的足细胞,分别于第0、4、8、12、24小时收集足细胞,用Western blot方法,检测HO-1蛋白表达。根据实验结果选取最佳干预时间点为24h,进行下一步实验。3分组一:将成熟足细胞随机分为正常糖、高糖、高糖+红景天苷(50μM)组,培养足细胞24h,用Western blot方法检测各组足细胞Nrf-2的表达。分组二:将足细胞随机分为正常糖组、高糖组、高糖+红景天苷(50μM)组、高糖+红景天苷(50μM)+SnPPIX(HO-1抑制剂,10μM,1h)组培养24h后收集足细胞,用流式细胞术检测细胞总ROS含量,用Western blot方法检测Caspase-9、Caspase-3的表达。分组三:将足细胞随机分为正常糖组、高糖组、高糖+红景天苷(50μM)组培养24h,其中高糖+红景天苷组在细胞培养12h时再随机分为3组即:高糖+红景天苷(50μM)+Scramble siRNA(10nM,12h)对照组、高糖+红景天苷(50μM)+HO-1 siRNA(10nM,12h)组、高糖+红景天苷(50μM)+Nrf-2siRNA(10nM,12h)组。最后收集足细胞,用流式细胞术检测细胞总ROS含量,用Western blot方法检测Caspase-9、Caspase-3的表达。结果:1 Western blot结果显示:无论正常糖还是高糖环境中,加入红景天苷后足细胞HO-1表达均较加入前增多,且随干预浓度的增加而增加;当浓度为50μM时,HO-1表达水平最高。差异均具有统计学意义(P<0.05)。2于高糖环境下培养的足细胞中加入红景天苷(50μM),在不同时间点(4、8、12、24h)检测HO-1的表达。Western blot结果显示:与高糖组相比,高糖加入红景天苷4h时HO-1的表达略高,但差异无统计学意义(P>0.05)。高糖加入红景天苷培养8h、12h、24h时足细胞HO-1表达水平升高,且随干预时间延长而增加,在24h时HO-1表达量最高。差异均具有统计学意义(P<0.05)。3红景天苷对高糖环境下足细胞Nrf-2的表达Western blot结果显示:与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞Nrf-2表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4 HO-1抑制剂(SnPPIX,Sn)对高糖环境下足细胞总ROS含量的影响。流式细胞检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞总ROS含量较高;与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞总ROS含量降低;与高糖+红景天苷组相比,高糖+红景天苷+SnPPIX组足细胞总ROS含量增多。差异均具有统计学意义(P<0.05)。5 HO-1抑制剂(SnPPIX,Sn)对高糖环境下足细胞Caspase-9、Caspase-3表达量的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞Caspase-9、Caspase-3表达水平升高;与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞Caspase-9、Caspase-3表达水平下降;与高糖+红景天苷组相比,高糖+红景天苷+Sn PPIX组足细胞Caspase-9、Caspase-3表达增多。差异均具有统计学意义(P<0.05)。6 HO-1 siRNA、Nrf-2 siRNA对高糖环境下足细胞总ROS含量的影响。流式细胞检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞总ROS含量升高;与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞总ROS含量降低;与高糖+红景天苷+scrambled siRNA组相比,高糖+红景天苷+HO-1 siRNA组、高糖+红景天苷+Nrf2 siRNA组足细胞总ROS含量均增多。差异均具有统计学意义(P<0.05)。7 HO-1 siRNA、Nrf-2 siRNA对高糖环境下足细胞Caspase-9、Caspase-3表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞Caspase-9、Caspase-3表达增加;与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞Caspase-9、Caspase-3表达下降;与高糖+红景天苷+Scrambled siRNA组相比,高糖+红景天苷+HO-1 si RNA组、高糖+红景天苷+Nrf-2 si RNA组足细胞Caspase-9、Caspase-3的表达显著增加。差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1红景天苷能够抑制高糖环境中足细胞的氧化应激状态,从而发挥足细胞保护作用。2红景天苷对高糖环境中足细胞的保护作用还可能与其抑制足细胞凋亡有关。3红景天苷的足细胞保护作用可能通过上调HO-1、Nrf-2的表达来实现。第三部分红景天苷调节高糖环境下小鼠足细胞HO-1表达与信号转导机制的研究目的:第二部分实验显示,红景天苷可能通过上调HO-1及Nrf-2的表达表达减轻高糖环境下足细胞氧化应激及凋亡,但其具体信号转导机制尚不明确。研究已证实磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径是重要的抗凋亡信号通路,可上调HO-1表达而起到细胞保护作用。整合素链接激酶ILK可通过与PI3K产物相结合而激活,实现对PI3K/Akt通路的调控,发挥抗细胞凋亡的作用。有研究显示,细胞外信号调节激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)和p38,也参与氧化应激和凋亡的调控。本部分实验旨在探讨红景天苷能否通过调节ILK/PI3K/Akt等通路来上调HO-1及Nrf-2的表达,减轻足细胞损伤。方法:1培养条件性永生化小鼠足细胞,成熟足细胞同步化后用于实验观察。2随机分组一:正常糖组、高糖组、高糖+红景天苷0.5h组(30μM HG+50μM SAL,0.5 h)、高糖+红景天苷1h组(30μM HG+50μM SAL,1 h)、高糖+红景天苷1.5h组(30μM HG+50μM SAL,1.5 h)、高糖+红景天苷2h组(30μM HG+50μM SAL,2h)。用Western blot方法检测磷酸化ILK(p-ILK)及磷酸化Akt(p-Akt)的表达。随机分组二:正常糖组、高糖组(30 mM HG)、高糖+红景天苷5min组(30mM HG+50μM SAL,5min)、高糖+红景天苷10min组(30mM HG+50μM SAL,10min)、高糖+红景天苷15min组(30mM HG+50μM SAL,15min)、高糖+红景天苷20min组(30mM HG+50μM SAL,20min)。用Western blot方法检测p-ERK、p-JNK、p-p38的表达。随机分组三:正常糖组、高糖组、高糖+红景天苷组(HG 30 mM+SAL50μM),高糖+红景天苷+PD98059(ERK抑制剂,25μM,0.5h)组、高糖+红景天苷+SP600125(JNK抑制剂,20μM,0.5h)组、高糖+红景天苷+SB203580(p38抑制剂,10μM,1h)组、高糖+红景天苷+LY294002(PI3K抑制剂,50μM,1h)组、高糖+红景天苷+QLT0267(ILK抑制剂,50μM,0.5h)组。用Western blot方法检测足细胞HO-1及Nrf-2的表达情况。结果:1红景天苷对高糖环境下足细胞p-ILK、p-Akt表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组p-Akt表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);而p-ILK表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。在高糖中加入红景天苷培养足细胞0.5、1、1.5、2h后,各时间点p-Akt和p-ILK的表达均较高糖组增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。2红景天苷对高糖环境下足细胞p-ERK、p-JNK和p-p38表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组p-p38表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);p-JNK和p-ERK表达稍降低,差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比,高糖+红景天苷15min组、高糖+红景天苷20min组培养足细胞p-JNK和p-ERK的表达增加,而p-p38的表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3分别抑制ERK、JNK、p38通路对高糖环境下足细胞HO-1表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞HO-1表达略低,差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞HO-1表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高糖+红景天苷组相比,高糖+红景天苷+SP600125(JNK抑制剂)组HO-1表达明显下降;而高糖+红景天苷+PD98059(ERK1/2抑制剂)组、高糖+红景天苷+SB203580(p38抑制剂)组HO-1表达增多,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4抑制PI3K或ILK对高糖环境下足细胞HO-1表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞HO-1表达略下降,差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞HO-1表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+红景天苷组相比,高糖+红景天苷+QLT0267(ILK抑制剂)组、高糖+红景天苷+LY294002(PI3K抑制剂)组足细胞HO-1表达均下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5分别阻断ERK、JNK、P38及PI3K对高糖环境下足细胞Nrf2表达的影响。Western blot结果显示:与正常糖组相比,高糖组足细胞Nrf2表达略下降,差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比,高糖+红景天苷组足细胞Nrf2表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高糖+红景天苷组相比,高糖+红景天苷+SP600125(JNK抑制剂)组、高糖+红景天苷+LY294002(PI3K抑制剂)组Nrf-2表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05);而高糖+红景天苷+PD98059(ERK抑制剂)组、高糖+红景天苷+SB203580(p38抑制剂)组Nrf-2表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1红景天苷可能通过ILK或PI3K/Akt途径上调高糖环境下小鼠足细胞HO-1及Nrf2表达。2红景天苷可能JNK途径增加高糖环境下小鼠足细胞HO-1的表达。3 ERK或p38MAPK通路可能参与了高糖环境下小鼠足细胞的损伤过程。综上,本研究显示了高糖环境下小鼠足细胞的氧化应激水平升高,细胞凋亡增加,而红景天苷具有减轻高糖环境下小鼠足细胞氧化应激状态,减少足细胞凋亡的作用。其机制可能与上调HO-1、Nrf2的表达有关,信号转导通路ILK/PI3K/Akt和JNK可能在此过程中发挥一定作用。