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目的:本课题组前期研究表明,野蔷薇苷(Rosamultin)是藏药“蕨麻”中提取的活性单体成分,可以发挥抗氧化、抗缺血、耐缺氧损伤等多种药理活性作用,能够明显减轻缺氧诱导的血管内皮细胞、神经元细胞和心肌细胞损伤。但目前关于野蔷薇苷的体内抗缺氧活性及其抗缺氧分子调控机制未见报道。因此,本实验在前期研究的基础上,以清洁级Sprague Dawley大鼠为研究对象,建立急性低压缺氧损伤模型,观察野蔷薇苷对急性低压缺氧诱发大鼠脑水肿的保护作用,并初步探讨其作用机制。由于急性缺氧性脑水肿与血管内皮细胞的功能失调密切相关,因此,本课题进一步通过体外血管内皮细胞的缺氧损伤模型,深入分析野蔷薇苷对PI3K/Akt信号通路的表达调控,从而探讨野蔷薇苷对抗急性缺氧性脑损伤的分子机制。方法:研究内容分为两部分。第一部分:野蔷薇苷对急性低压缺氧大鼠脑损伤的保护作用及对pAkt蛋白的表达调控1实验分组:将50只成年雄性SD大鼠随机分为5组:常氧对照组(C),缺氧模型组(M),野蔷薇苷高剂量组(H),野蔷薇苷低剂量组(L),地塞米松组(N)。2急性低压缺氧模型的建立:除常氧对照组外,其他各组均采用低压氧舱建立大鼠急性低压缺氧模型,模拟海拔7000 m高原环境(温度15±2℃,湿度30%±5%)缺氧18 h。常氧对照组大鼠相同温、湿度舱外正常饲养。3采用生化手段检测各组大鼠脑海马组织中LDH、SOD活性和MDA、GSH含量,以及血浆中NO含量。4采用干湿比重法计算各组大鼠脑含水量,观察各组大鼠脑水肿情况。5通过H.E染色法观察各组大鼠脑组织形态学变化。6应用免疫组织化学染色法,观察各组大鼠脑组织中AQP1和AQP4表达变化情况。7利用免疫印迹技术(Western Blot),观察各组大鼠脑组织中pAkt蛋白表达变化情况。第二部分:PI3-K/Akt通路介导野蔷薇苷对抗急性缺氧诱导的血管内皮细胞损伤机制研究1实验分组:取对数生长期的人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,随机分为正常对照组(C)、PI3K抑制剂(LY294002)高、中、低浓度处理组(LY20、LY10、LY5)、缺氧模型组(M)、缺氧+LY294002高、中、低浓度处理组(M+LY20、M+LY10、M+LY5)、缺氧+野蔷薇苷处理组(Y10)、缺氧+野蔷薇苷+LY294002高、中、低浓度处理组(Y10+LY20、Y10+LY10、Y10+LY5)、缺氧+野蔷薇苷+2-Methoxyestradiol处理组(Y10+2-Me)。2急性缺氧损伤模型的建立:利用三气培养箱建立急性缺氧损伤模型(5%CO2,95%N2,37℃),缺氧2 h,正常对照组细胞同步培养于二氧化碳培养箱(5%CO2,37℃)。3通过MTT法观察各组细胞代谢活力的变化;采用生化手段检测各组细胞培养液中LDH外漏量以及各组细胞内MDA、GSH含量和SOD、CAT活性。4通过台盼蓝排斥实验检测各组血管内皮细胞的细胞膜完整性和存活率。5运用Hochest/PI双重染色和DAPI染色技术,观察各组血管内皮细胞凋亡形态学变化。6采用流式细胞术测定各组血管内皮细胞凋亡率。7通过免疫荧光细胞染色法,观察各组细胞中pAkt的表达情况,探讨野蔷薇苷对缺氧损伤血管内皮细胞中Akt磷酸化水平的调控作用。8利用Western Blot技术,观察各组细胞中Akt,pAkt,HIF-1α,HIF-1β,Bax,Bcl-2,Cyt C,Caspase-9,pro-Caspase-3,cleaved-Caspase-3等蛋白表达变化,探讨野蔷薇苷减轻缺氧诱导血管内皮细胞损伤可能的分子机制。结果:第一部分:野蔷薇苷对急性低压缺氧大鼠脑损伤的保护作用及对pAkt蛋白的表达调控1与常氧对照组相比,急性低压缺氧模型组大鼠脑海马中LDH活性和MDA含量均显著上升(P<0.01),GSH含量、SOD活性和血浆中NO含量均显著下降(P<0.01或P<0.05);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷高、低剂量组和地塞米松组大鼠脑海马中LDH活性和MDA含量均显著下降(P<0.01),GSH含量、SOD活性和血浆中NO含量均显著上升(P<0.01或P<0.05)。2与常氧对照组相比,急性低压缺氧模型组大鼠脑含水量显著增加(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷高、低剂量组和地塞米松组大鼠脑含水量均显著降低(P<0.01或P<0.05)。3H.E染色结果显示:急性低压缺氧模型组大鼠软脑膜与脑皮质明显分离,间隙可见大量红染细胞,脑皮质中毛细血管周围间隙变大,脑海马区神经细胞出现凋亡或坏死;给予不同剂量野蔷薇苷和地塞米松处理后均能明显改善缺氧导致的大鼠脑组织病理学改变。4免疫组化结果显示:与常氧对照组相比,急性低压缺氧模型组大鼠脑组织中AQP1和AQP4阳性表达细胞数量均显著增多(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷高、低剂量组和地塞米松组大鼠脑组织中AQP1和AQP4阳性表达细胞数量均显著减少(P<0.01)。5与常氧对照组相比,急性低压缺氧模型组大鼠脑组织中pAkt表达水平显著升高(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷高剂量组大鼠脑组织中pAkt表达水平显著升高(P<0.01)。第二部分:PI3-K/Akt通路介导野蔷薇苷对抗急性缺氧诱导的血管内皮细胞损伤机制研究1 MTT结果显示:与缺氧模型组相比,LY294002高、中、低浓度组血管内皮细胞代谢活力均显著降低(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷组血管内皮细胞代谢活力显著提高(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组血管内皮细胞代谢活力显著降低(P<0.01)。2 酶学指标检测结果显示:与正常对照组相比,缺氧模型组血管内皮细胞培养液中LDH外漏量及细胞内MDA含量均显著增多(P<0.01),GSH含量及CAT、SOD活性均显著降低(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷组血管内皮细胞培养液中LDH外漏量及细胞内MDA含量均显著降低(P<0.01),GSH含量及CAT、SOD活性均显著升高(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组细胞LDH外漏量及细胞内MDA含量均显著增多(P<0.01或P<0.05),GSH含量及CAT、SOD活性均显著降低(P<0.01或P<0.05)。3台盼蓝染色结果显示:与正常对照组相比,缺氧模型组蓝染细胞数量显著增多(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷组蓝染细胞数量显著减少(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组蓝染细胞数量显著增多(P<0.01)。4 Hochest/PI双染和DAPI染色结果显示:野蔷薇苷处理能够明显减少缺氧诱导的凋亡细胞数量增多,给予LY294002可抵消野蔷薇苷的保护作用。5 流式细胞术结果显示:与正常对照组相比,缺氧模型组血管内皮细胞凋亡率显著上升(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷组细胞凋亡率显著下降(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组细胞凋亡率显著上升(P<0.01)。6 免疫荧光染色结果显示,正常组细胞中FITC标记的绿色荧光(pAkt)强度极其微弱,缺氧后荧光强度明显增强,野蔷薇苷处理后荧光强度进一步增强,但给予LY294002处理可明显降低细胞内绿色荧光强度。7 Western blot结果显示:与正常对照组相比,缺氧模型组血管内皮细胞中pAkt、HIF-1α表达水平均显著升高(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷组细胞中pAkt、HIF-1α表达水平均显著升高(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组pAkt、HIF-1α表达水平均显著降低(P<0.01)。8 Western blot结果显示:与正常对照组相比,缺氧模型组血管内皮细胞中Bax、Cyt C、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表达水平均显著升高(P<0.01),Bcl-2和pro-Caspase-3表达水平显著降低(P<0.01);与缺氧模型组相比,野蔷薇苷处理组血管内皮细胞中Bax、Cyt C、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表达水平均显著降低(P<0.01),Bcl-2和pro-Baspase-3表达水平显著升高(P<0.01);与野蔷薇苷组相比,野蔷薇苷和LY294002共处理组及野蔷薇苷和2-Me共处理组细胞中Bax、Cyt C、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表达水平均显著升高(P<0.01),Bcl-2和pro-Caspase-3表达水平均显著降低(P<0.01)。结论:1野蔷薇苷可通过提高大鼠的抗氧自由基能力,对急性低压缺氧诱导的大鼠脑损伤起保护作用。2野蔷薇苷可通过抑制AQP1和AQP4的过表达,减轻急性低压缺氧诱发的大鼠脑水肿。3野蔷薇苷对抗急性低压缺氧性脑损伤的作用可能与其上调pAkt的表达有关。4野蔷薇苷可通过激活PI3K/Akt信号通路,继而上调HIF-1α表达,改善急性缺氧诱导血管内皮细胞的功能损伤。