研究背景腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)作为基因治疗的病毒载体,具有体内表达时间长、宿主范围广、免疫原性低、安全性高等优点,是基因治疗研究中最有应用前景的基因载体之一。虽然第一个以该病毒为载体的基因药物Glybera已在欧盟获批上市,然而仍然存在AAV病毒载体的纯化工艺复杂、纯化效率低、成本高等问题。亲和纯化是AAV病毒较为理想的纯化方法,具有高选择性、高吸附率、高回收率的优点。AAV的亲和纯化一般以AAV的特异受体为配基,由于之前发现的受体一般只特异性吸附一种血清型AAV,导致纯化柱功能单一、纯化过程繁琐、纯化成本较高。最近发现的腺相关病毒受体–AAVR,报道称AAVR是多种血清型腺相关病毒的受体,将AAVR作为亲和纯化柱的配基有望解决一种受体亲和纯化柱只能纯化一种血清型AAV的问题。酵母表面展示技术是将外源靶蛋白基因和酵母细胞壁蛋白基因序列融合后导入酵母细胞,用酵母细胞壁蛋白表达与转运机制将目的蛋白转移并且固定在酵母细胞外表面的一种技术。将AAVR展示在酵母表面后,利用表面展示AAVR的酵母代替链接配基的纯化柱基质,来特异性纯化病毒,可以减少配基和基质化学交联带来的污染,避免交联条件苛刻等问题。研究目的构建酵母表面展示AAVR的亲和纯化系统,为解决现有亲和柱纯化病毒过于单一、配基和基质化学交联效率低、污染大、成本较高等问题做初步研究。研究方法(1)查阅文献获得AAVR有效结构域的基因序列,并进行结构分析;(2)设计引物提取AAVR的基因片段;(3)构建含有AAVR基因片段的表面展示质粒;(4)表面展示AAVR的酵母电转、筛选、表达;(5)检测AAVR的展示效果与病毒吸附效果;(6)检测表面展示AAVR的酵母对病毒的纯化及洗脱效果;(7)调节洗脱液的盐离子浓度、pH值等优化纯化效果;研究结果(1)通过查阅文献发现AAVR有效结构域为PKD(polycystic kidney disease)1-5,并进行结构分析,去除信号肽区和穿膜肽区的序列,最后选取311-788氨基残基。(2)根据311-788氨基残基对应的DNA序列(PKD)设计引物,在L02细胞(人正常肝细胞)中提取全RNA,利用设计的引物通过逆转录提取了311-788氨基残基对应的DNA序列。(3)将PKD基因序列插入到表面展示质粒PYD1中,构建了PKD-PYD1融合表面展示质粒。(4)通过电转化将PKD-PYD1融合表面展示质粒成功导入到表面展示酵母EBY100中。(5)初步探索了表面展示AAVR的酵母吸附AAV的影响因素及洗脱条件。研究结论比较成功地构建了表面展示AAVR的酵母,为下一步详细探索纯化工艺打下了前期基础,经过初步实验,发现其对AAV的结合效率较低,纯化效果没有明显优势,有待进一步改善结合过程和洗脱条件。