论文部分内容阅读
目的:宫颈癌是新疆高发肿瘤,人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是重要病因,其中HPV16感染占有主导地位。前期工作中,本团队通过宫颈癌的血清代谢组学研究,发现宫颈癌与小分子代谢物水平变化存在因果关系,但是与肿瘤组织内在代谢调控的关系有待进一步研究。故本课题拟从宫颈癌患者及宫颈癌细胞模型水平上,明确宫颈癌及HPV感染与小分子代谢谱变化和关键代谢途径的限速酶表达水平的关系,探讨宫颈癌发生的代谢调控机理和早期预警指标。方法:1)收集宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ～Ⅲ患者及正常对照(normal control,NC)的新鲜组织标本52例,其中CSCC患者21例,CINⅡ～Ⅲ患者20例,对照组11例;以病例回顾的方式,获取宫颈癌、癌前病变(CIN)和正常对照(或宫颈炎)组织切片123例;2)提取组织DNA和HPV分型后,依托高分辨魔角旋转核磁共振技术(High-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance,HRMAS-~1HNMR)技术平台,对HPV阴性正常对照、HPV16阳性宫颈癌和癌前病变组织进行代谢谱鉴定,并通过专用代谢组学数据分析软件和在线人类代谢组学数据库(http://www.hmdb.ca)综合分析,明确肿瘤组织和HPV16感染共性的候选差异表达代谢物群;3)为了提高代谢组学测试灵敏度,选择超高效液相色谱联合三重四级杆串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术,进一步明确肿瘤组织和HPV感染共性的候选差异表达代谢物,并通过代谢途径鉴别软件(KEGG;MetaboAnalyst 2.0)及其在线代谢组学数据库,确定宫颈癌组织代谢调控相关的特定代谢途径及其限速酶;4)提取组织RNA,根据上述代谢途径限速酶预测结果,设计与合成特定限速酶编码基因的mRNA序列特异性引物,对宫颈癌和正常对照组织进行定量RT-PCR分析,明确宫颈癌组织病变与特定限速酶mRNA表达水平的关系;同时,利用临床病理组织标本库提供的石蜡包埋组织切片,对宫颈癌、癌前病变和正常对照组织进行免疫组织化学分析,进一步明确宫颈癌组织病变与限速酶蛋白质表达水平的关系;5)设计6种HPV16编码的E6或E7基因序列同源的RNAi寡核苷酸片段,选择同步表达RNAi片段及绿色荧光蛋白质(Green fluorescent protein,GFP)的pRNAi质粒载体,构建表达E6或E7 RNAi片段的载体,以此瞬时转染HPV16阳性的SiHa宫颈癌细胞,以激光共聚焦显微镜观察,评价载体转染效率,建立RNAi细胞模型;采用核磁共振技术和定量RT-PCR方法,对RNAi细胞模型和正常对照细胞的代谢谱、宫颈癌相关代谢途径的限速酶表达水平分析,从细胞水平上,明确HPV16感染与宫颈癌细胞代谢和限速酶表达调控的依存关系。结果:1)根据52例组织标本的HPV鉴定及高危型HPV16、18、33、52、58和67分型,共检出HPV阳性39例,其中CSCC患者20例,CINⅡ～Ⅲ患者18例,正常对照1例;检出HPV16阳性37例,其中CSCC患者19例,CINⅡ～Ⅲ患者17例,正常对照1例,HPV16/HPV阳性比例很高(37/39),HPV16感染占主导地位;2)根据HPV分型结果,选择HPV阴性正常对照和HPV16阳性宫颈癌及癌前病变组织标本,通过核磁共振代谢组学研究,鉴别出17种宫颈癌及HPV16感染共性差异表达的小分子代谢物,推测宫颈癌患者体内糖脂和氨基酸分解代谢加剧,能量代谢加强,处于物质代谢紊乱的病理状态;3)根据超高效液相色谱联合三重四级杆串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析结果,正常对照、宫颈癌和癌前病变组织之间有34种差异表达的小分子代谢物;通过上述代谢组学数据的代谢通路分析软件(MetaboAnalyst和KEGG)综合分析,预测出18条关键代谢通路,其中牛磺酸和亚牛磺酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢及硫胺素代谢等4条代谢可能与宫颈癌发生密切相关;4)根据上述代谢组学研究结果,并按照糖脂和氨基酸分解代谢调控的研究思路,选择了谷氨酸脱羧酶1(Glutamate decarboxylase 1,GAD1)、糖原合成激酶3(Glycogen synthesis kinase 3,GSK-3)GSK-3β、肌肉丙酮酸激酶同工酶2(Pyruvate kinase muscle isozyme 2,PKM2)和肉毒碱棕榈酰基转移酶(Carnitine palmitoyl transferase IA,CPTI A1)等4种代谢限速酶,其中GAD1调节氨基酸分解代谢,GSK-3调节糖分解代谢、糖异生和糖原合成,PKM2调节糖氧化分解,CPTI A1调节脂肪酸分解代谢;根据61例宫颈癌和正常对照组织的定量RT-PCR分析结果,宫颈癌内GAD1和GSK-3β转录表达水平显著下调(P<0.05),PKM2和CPT1表达水平显著上调(P<0.05);免疫组织化学分析结果显示,从正常对照到癌前病变(CINⅡ～Ⅲ)和宫颈癌,GAD1和GSK-3β蛋白质表达水平逐渐下降,PKM2和CPT1蛋白质表达水平逐渐上升,均有显著差异(P<0.05),此进一步验证了定量RT-PCR分析结论;5)构建了HPV16编码基因E6和E7的RNAi表达载体,以此转染SiHa宫颈癌细胞(HPV16阳性),同步表达RNAi片段和绿色荧光蛋白质(GFP),通过激光共聚焦显微成像分析,评价转染效率,建立了RNAi细胞模型;通过基于RNAi细胞模型的代谢谱和定量RT-PCR分析,RNAi细胞模型系列与正常对照细胞相比较,共有13种差异表达的小分子代谢物,GAD1和GSK-3β表达水平上调,而PKM2和CPT1表达水平下调,其变化趋势与上述基于宫颈癌组织内表达水平变化趋势正好相反,提示HPV16编码基因表达可能影响上述限速酶介导代谢调节过程,为从代谢调控水平上揭示HPV16致病和致癌生物学本质提供了重要依据。结论:1)宫颈癌发生及HPV感染伴有肿瘤组织内糖脂和氨基酸分解代谢加剧,能量代谢增强,处于物质代谢紊乱的病理状态;2)宫颈癌发生及HPV感染与肿瘤组织内关键代谢途径的限速酶表达调控存在密切关系;3)HPV16编码基因E6或E7表达可能影响宫颈癌细胞代谢调节和关键代谢途径的限速酶表达调控。