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目的:1.通过生物信息学分析MUC1在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达差异情况、MUC1在卵巢癌不同分期中的表达,以及与患者预后的关系,同时在组织及细胞水平验证MUC1的表达差异。2.探讨MUC1基因表达与卵巢癌细胞增殖、凋亡的关系,并验证在高糖处理下MUC1的表达水平及其O-GlcNAc糖基化修饰水平。3.阐明O-GlcNAcylation通过修饰c-Jun调控MUC1促进卵巢癌增殖的作用机制。方法:1.通过生物信息学分析MUC1在卵巢癌和正常卵巢组织中差异表达(m RNA和蛋白水平)、不同分期中MUC1表达情况以及Kaplan-Meier生存曲线分析MUC1与卵巢癌患者预后之间的关系。2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blot方法分别检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中MUC1的m RNA和蛋白的表达的差异。3.qRT-PCR和western blot方法分别检测五株卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3、UWB1.289、Caov-3、HO-8910)和正常卵巢上皮细胞(IOSE80)的m RNA和蛋白表达的差异。4.通过细胞转染技术,将MUC1干扰序列和过表达序列转染卵巢癌细胞,CCK8检测细胞增殖能力;细胞克隆形成实验检测克隆形成情况;流式细胞术(Annexin V/PI染色法)检测细胞凋亡。5.高糖处理卵巢癌细胞,对照组为无高糖处理,qRT-PCR和western blot方法分别检测MUC1 m RNA和蛋白的表达;分别对卵巢癌细胞进行高糖及高糖+敲减MUC1处理,CCK8检测细胞增殖能力;细胞克隆形成实验检测克隆形成情况;流式细胞术(Annexin V/PI染色法)检测细胞凋亡;O-GlcNAc糖基化酶标记实验和免疫共沉淀法(Co-IP)检测MUC1糖基化水平。6.通过生物信息学预测MUC1的上游转录因子c-Jun;染色质免疫共沉淀(Chip)实验和双荧光素酶报告基因检测实验证实转录因子c-Jun是否与MUC1启动子区域结合;将c-Jun干扰序列和过表达序列转染卵巢癌细胞,qRT-PCR和western blot方法分别检测MUC1 m RNA和蛋白的表达。7.高糖处理卵巢癌细胞,对照组为无高糖处理,qRT-PCR和western blot方法检测卵巢癌细胞中c-Jun的m RNA和蛋白的表达;使用糖基化促进剂PUGNAc和GlcNAc处理卵巢癌细胞,未处理做为阴性对照,检测c-Jun的m RNA和蛋白的表达;放线菌酮(CHX)追踪实验检验c-Jun蛋白的稳定性;糖基化酶标实验和Co-IP检测c-Jun糖基化情况;使用糖基化促进剂PUGNAc和GlcNAc处理卵巢癌细胞,同时敲减c-Jun,CCK8检测细胞增殖能力;细胞克隆形成实验检测克隆形成情况;流式细胞术(Annexin V/PI染色法)检测细胞凋亡;过表达c-Jun和MUC1,western blot检测O-GlcNAc糖基化水平。8.在卵巢癌细胞中过表达c-Jun,western blot检测O-GlcNAc糖基化相关蛋白(OGT、GUCY1A3、UAP1及SGLT1)的变化;过表达c-Jun后,再敲减SGLT1,western blot检测c-Jun蛋白的O-GlcNAc糖基化水平;敲减SGLT1后,qRT-PCR和western blot分别检测卵巢癌细胞MUC1 m RNA和蛋白的表达情况。结果:1.生物信息学网站挖掘MUC1在卵巢癌和正常卵巢组织中的差异表达、不同分期的表达情况及Kaplan-Meier生存曲线分析MUC1与卵巢癌患者预后之间的关系(1)与正常卵巢组织相比,MUC1在卵巢癌组织中m RNA和蛋白的表达均显著增高。(2)MUC1在不同分期的卵巢癌组织中表达水平具有显著差异,且在IV期肿瘤中表达量最高。(3)高表达MUC1患者的生存率明显低于MUC1低表达组。2.MUC1在卵巢癌组织中的表达与正常卵巢组织相比,MUC1在卵巢癌组织中m RNA和蛋白的表达升高。3.MUC1在卵巢癌细胞中的表达与正常卵巢癌上皮细胞(IOSE80)相比,MUC1在卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3、UWB1.289、CAOV-3、HO-8910)中m RNA和蛋白表达均升高。4.MUC1在卵巢癌细胞中增殖、凋亡的作用与对照组相比,过表达MUC1可促进细胞增殖(CCK-8)和细胞克隆集落的形成(细胞克隆形成实验),而敲减MUC1可降低细胞增殖和细胞克隆集落的形成;与对照组相比,过表达MUC1细胞凋亡减少,而敲减MUC1细胞凋亡增加。5.高糖和MUC1对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及MUC1的糖基化水平检测结果(1)与对照组相比,高糖处理后的细胞中MUC1的m RNA和蛋白表达均升高。(2)与对照组相比,高糖处理后的卵巢癌细胞增殖和细胞克隆集落形成能力增加,凋亡减少;与高糖处理组相比,高糖+敲减MUC1处理组卵巢癌细胞增殖和细胞克隆集落形成能力均减弱,凋亡增加。(3)MUC1蛋白在卵巢癌细胞中未发生O-GlcNAc糖基化修饰。6.MUC1上游转录因子c-Jun对其调控的机制研究(1)通过生物信息学网站找到MUC1的上游转录因子c-Jun。(2)染色质免疫共沉淀(Chip)实验和双荧光素酶报告基因检测实验证实转录因子c-Jun可与MUC1的启动子结合。(3)与对照组相比,过表达c-Jun,MUC1的m RNA和蛋白表达量均升高,敲减c-Jun后,MUC1表达量均降低。7.c-Jun和O-GlcNAc糖基化修饰在促进卵巢癌细胞增殖抑制凋亡中的作用以及c-Jun对O-GlcNAc糖基化的影响(1)高糖处理卵巢癌细胞,c-Jun的表达变化在高糖环境下,卵巢癌细胞中c-Jun m RNA水平无显著变化;c-Jun蛋白表达水平显著升高。(2)糖基化促进剂处理卵巢癌细胞,c-Jun的表达变化使用糖基化促进剂PUGNAc和GlcNAc处理卵巢癌细胞后,细胞中c-Jun m RNA和蛋白水平均显著升高。(3)糖基化促进剂处理卵巢癌细胞,CHX实验检测c-Jun蛋白的稳定性糖基化促进剂处理细胞后c-Jun蛋白的稳定性增加。(4)在卵巢癌细胞中,检测c-Jun的O-GlcNAc糖基化c-Jun可以发生O-GlcNAc糖基化修饰。(5)c-Jun和O-GlcNAc糖基化修饰在促进卵巢癌细胞增殖抑制凋亡中的作用与对照组相比,糖基化促进剂(PUGNAc和GlcNAc)可显著增加卵巢癌细胞的增殖和细胞克隆形成能力,细胞凋亡减少;而敲减c-Jun后可部分逆转O-GlcNAc糖基化促进剂对卵巢癌细胞的增殖作用。(6)c-Jun对O-GlcNAc糖基化的影响c-Jun水平的上调会引起O-GlcNAc糖基化水平的升高,而MUC1水平的上调对O-GlcNAc糖基化修饰影响不大。8.c-Jun促进O-GlcNAc糖基化修饰的相关蛋白检测(1)与对照组相比,过表达c-Jun基因后,O-GlcNAc糖基化相关蛋白SGLT1升高最明显。(2)与对照组相比,过表达c-Jun基因后,O-GlcNAc糖基化水平升高,而在过表达c-Jun同时敲减SGLT1后,O-GlcNAc糖基化水平降低。(3)在卵巢癌细胞中,敲减SGLT1后,MUC1 m RNA和蛋白表达水平均降低。结论:1.MUC1在卵巢癌中高表达(组织和细胞水平),与患者不良预后相关,MUC1可促进卵巢癌细胞的增殖、抑制凋亡。2.O-GlcNAc糖基化修饰促进MUC1基因的表达,作用机制是增加其转录因子c-Jun蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰。同时,c-Jun蛋白的表达增加也可促进O-GlcNAc糖基化水平的升高。O-GlcNAcylation/c-Jun可形成一个正反馈环路,进而促进卵巢癌细胞的增殖、抑制凋亡。3.O-GlcNAcylation/c-Jun轴通过SGLT1正向调节O-GlcNAc糖基化,反过来,SGLT1下调可降低O-GlcNAc糖基化水平和MUC1的表达。