目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是一个全球性健康问题,迄今全球约有1.7-2.0亿HCV感染者,目前仍无有效的防治方法。因此,开发有效的预防和治疗性HCV疫苗,就成了一个亟待解决的问题。E2蛋白是HCV最重要的中和靶抗原,可诱导机体产生HCV的中和抗体,但因其能与人CD81分子结合,使B细胞激活的正常信号传导通路发生变化,导致B淋巴细胞的异常激活和增殖紊乱,从而产生免疫抑制作用而可能不适合用作疫苗的靶抗原。现已证明HCV E2蛋白中与CD81分子结合的位点包括E2蛋白的481-491及544-551位氨基酸残基,对这两个位点进行突变使之不再结合人CD81分子而仍然保持其天然构型和中和表位。故这种结构优化的HCV E2蛋白有望成为丙肝疫苗的有效靶抗原。腺病毒以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、高水平表达外源基因且诱导机体产生针对目的蛋白的免疫应答、上调抗原提呈细胞协同刺激因子的表达、无插入突变性等优点,成为极具应用前景的基因转移载体。因此,本实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2(recombinant adenovirus E2、recombinant adenovirus△E2),并且对rAd/E2诱导的特异性免疫应答进行了研究,为丙型肝炎疫苗的研制探索新的途径。方法: (1)目的基因的扩增与鉴定:以pEGFP-HCV/E1E2为模板,扩增E2目的基因。将扩增产物与pGEM-T载体连接,转化感受态菌E.coli DH5α,提取质粒进行PCR、酶切鉴定及测序,筛选重组子。(2)真核表达质粒pcDNA3.0/E2的构建:将鉴定正确的质粒pGEM-T/E2用适当的限制性内切酶酶切,胶回收目的片段,并与经相同酶切的pcDNA3.0质粒载体连接。经转化、筛选、PCR和酶切鉴定,构建真核表达质粒pcDNA3.0/E2。(3)突变质粒pcDNA3.0/△E2的构建:分别在HCV481-491及544-551位氨基酸残基序列中随机选择预突变位点(486aa的半胱氨酸预突变为苯丙氨酸;544、545aa的脯氨酸分别预突变为亮氨酸、丙氨酸),各设计一对突变引物,然后分别以pcDNA3.0/E2为模板进行一步法PCR介导的突变反应,得到两种独立含有各自突变位点的突变质粒pcDNA3.0/△E2①、pcDNA3.0/△E2②;然后再用下段序列的突变引物,以pcDNA3.0/△E2①为模板再次进行PCR突变反应,得到上下段序列同时含有突变位点的质粒pcDNA3.0/△E2③。(4)重组穿梭质粒的构建:将pGEM-T/E2、pcDNA3.0/△E2用恰当的限制性内切酶双酶切,回收纯化目的片段,并与经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV连接,经转化、筛选、PCR和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△E2。(5)重组腺病毒质粒的构建:将重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△E2分别用内切酶PmeⅠ线性化,利用AdEasy系统,经两步法在大肠杆菌BJ5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd/E2、pAd/△E2。用PacⅠ酶切鉴定,将阳性质粒转化感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆,以碱裂解法大量提取重组质粒,并用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法进行纯化。(6)重组腺病毒的包装与扩增:将重组腺病毒质粒pAd/E2、pAd/△E2分别用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293细胞,并观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293细胞,进行第二轮扩增,同法进行第三、四轮大量扩增,大量收集第四代病毒液,用腺病毒纯化试剂盒进行纯化。(7)重组腺病毒滴度测定:待293细胞在96孔板中生长至70-80%汇合时,以不同稀释倍数的各代病毒液感染细胞,培养48h后,以GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度(病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量)。(8)用PCR、RT-PCR分别对重组腺病毒进行鉴定,同时用第三代重组腺病毒rAd/E2感染293细胞,24-48h后,收集细胞,Western blot法检测HCV E2的表达。(9)同法扩增并纯化本室前期构建的Ad,并测定病毒滴度。(10)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中提取质粒pcDNA3/E2,用聚乙二醇沉淀法进行纯化。(11)动物实验:将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组,分别为rAd/E2实验组、pcDNA3.0/E2阳性对照组、Ad阴性对照组和PBS空白对照组。疫苗采用股四头肌注射,其中rAd/E2组和Ad组每间隔2周免疫一次,共免疫两次;pcDNA3.0/E2组和PBS组每间隔3周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)进行淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤活性的检测。结果:(1)成功构建了质粒pGEM-T/E2,限制性酶切鉴定及测序结果与预期值相符。(2)成功构建了真核表达质粒pcDNA3.0/E2及三种突变质粒pcDNA3.0/△E2,其中pcDNA3.0/△E2①包含的预突变位点(486aa的半胱氨酸预突变为苯丙氨酸)位于HCV 481-491aa序列中; pcDNA3.0/△E2②包含的预突变位点(544及545aa的脯氨酸分别预突变为亮氨酸、丙氨酸)位于HCV 544-551aa序列中;pcDNA3.0/△E2③同时包含上述两段序列中的突变位点。(3)成功构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2、pAdTrack-CMV/△E2,PCR鉴定及限制酶切分析证明符合预期设计。(4)成功构建重组腺病毒质粒pAd/E2、pAd/△E2,用PacⅠ酶切均得到约30kb的大片段和一个4.5kb的小片段。(5)成功包装并扩增纯化重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2。(6)重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2①-③初代至第四代病毒滴度分别为:2.2×104 pfu/ml、4.0×107 pfu/ml、1.0×108pfu/ml、7.5×108 pfu/ml;2.5×104 pfu/ml、1.0×107 pfu/ml、2.65×108 pfu/ml、6.0×108 pfu/ml ; 3.0×104pfu/ml、4.1×107pfu/ml、3.7×108pfu/ml、9.5×108pfu/ml ; 1.8×104pfu/ml、4.0×106pfu/ml、6.7×107pfu/ml、3.9×108pfu/ml。(7) PCR对重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2病毒液鉴定;RT-PCR对第三代重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2感染的293细胞鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳均检测到特异性目的条带;三代rAd/E2病毒液感染293细胞24-48h后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测到细胞中有E2蛋白的表达。(8)小鼠脾淋巴细胞增殖试验分别以灭活的重组腺病毒rAd/E2病毒液和刀豆蛋白A (concanavalin A,ConA)体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。其中阳性对照ConA刺激时,各组均检测到淋巴细胞非特异性增殖,以rAd/E2病毒液刺激时,各组未见到显著的特异性淋巴细胞增殖。(9)小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,以重组腺病毒感染的SP2/0作为靶细胞时,Ad/E2组、Ad组及pcDNA3.0/E2组均与PBS组有差别,Ad/E2组、Ad组与pcDNA3.0/E2组也有差别(P<0.05),但是Ad/E2组、Ad组两组无差别;以pcDNA3.0/E2转染SP2/0作为靶细胞时,各组间均无差别(P>0.05)。结论:本研究利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒rAd/E2、rAd/△E2,为丙型肝炎疫苗的研制奠定了基础。