论文部分内容阅读
肌氨酸氧化酶（SOX,EC.1.5.3.1）是能够催化肌氨酸（N-甲基甘氨酸）去甲基化生成甲醛、甘氨酸和过氧化氢的黄素蛋白氧化酶之一。该酶在生物、医学和食品工业等领域有较好应用。本研究选用来源于Thermomicrobium roseum DSM 5159中预测的sox基因（trsox）,主要涉及TrSOX在E.coli中的异源表达与包涵体复性,trsox的随机突变,以及在枯草芽孢杆菌表达系统中的重组表达,期望获得可溶性表达量增加的TrSOX蛋白,进行结构和功能的研究。（1）TrSOX包涵体透析复性及酶学性质研究。优化后的trsox基因序列在E.coli表达系统中表达成功,但其表达产物主要为无活性的包涵体沉淀,为了使重组TrSOX包涵体具有酶活,采用尿素浓度梯度透析复性,获得了有活性的TrSOX复性酶。复性酶经镍柱纯化后进行酶学性质研究及SDS-PAGE分析。研究结果表明TrSOX复性酶在55℃时催化能力最强,温度低于60℃时,酶活保留率在80%以上,催化反应最适的pH为8.0,在7-10的pH范围内比较稳定,Km值为15.82 mmol·L-1,kcat为0.00065 s-1,蛋白半解折叠温度为62.4℃。（2）采用error-prone PCR进行定向突变,TrSOX在E.coli中的可溶性表达量有所增加。对trsox基因进行随机突变后,筛选到一株可溶性表达量略有增多的菌株。酶活测定后发现突变TrSOX可溶性表达量提高了25%,对突变前后的TrSOX进行酶学性质研究,发现突变后的最适反应温度和温度稳定性范围均减小,反应的最适pH增大。（3）TrSOX在Bacillus subtilis WB600中获得可溶性表达。分析发现TrSOX的可溶性表达量在E.coli中很难增加,而采用了B.subtilis WB600表达系统进行表达后,其可溶性表达量增加。TrSOX粗酶用镍柱亲和层析后在SDS-PAGE上表现为单一条带,经飞行时间质谱鉴定正确。对TrSOX纯酶进行酶学性质分析,发现其催化反应的最适温度为65℃,符合嗜热酶的特征,在0-80℃温度下,酶活保留率基本不变,其最适反应pH和pH稳定性与突变酶保持一致。TrSOX纯酶的比酶活力约是TrSOX复性酶的93倍,TrSOX纯酶的半解折叠温度为100℃,比其复性酶提高了37.6℃。（4）通过添加信号肽,使得TrSOX的胞内可溶性表达量增加。选择了6个信号肽,TrSOX分泌表达载体在B.subtilis WB600中成功表达,然而在胞外并没有测到酶活,但添加YwbN信号肽的TrSOX胞内表达量提高56%,可是胞内粗酶液经镍柱纯化后发现其酶活提纯率和比酶活均减小。