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目的:筛选特异性进入乳腺癌MDA-MB-231细胞的小肽,研究该小肽的细胞靶向性及体外转导活性,探讨其作为肿瘤靶向治疗载体的可行性,为肿瘤个体化治疗研究提供实验基础。方法:人乳腺癌细胞MDA-MB-231作为靶细胞,与pC89噬菌体肽库体外共培养;Subtilisin灭活未进入细胞的噬菌体;裂解细胞;细胞裂解液转化E.coliXLI-Blue扩增进入细胞的小肽噬菌体;扩增后的小肽噬菌体再与MDA-MB-231共培养。上述收集-扩增-再共培养的过程反复5轮,直至加入细胞培养液的小肽噬菌体与细胞裂解液中收集的小肽噬菌体数量一致。收集最后一轮共培养细胞的裂解液,转化大肠杆菌,划板,从板中随机挑取20个阳性克隆,噬菌体DNA测序,确定噬菌体上融合的外源性小肽的氨基酸序列。以RGD-integrin binding噬菌体作阳性对照,分别检测小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株、其他组织来源实体瘤细胞株以及正常细胞株的亲和性。合成无噬菌体外壳蛋白的PⅠ(PⅠ为20个噬菌体克隆中表达最高的融合小肽)序列并标记FITC,同时合成不含末端半胱氨酸PⅠ(C-)及调整氨基酸序列排列次序的PⅠ(S)序列,检测它们与其他乳腺癌细胞株、其他组织来源实体瘤细胞株以及正常细胞株的亲和特异性。编码乳腺癌细胞特异性多肽的DNA片段定向插入能够表达GST融合蛋白的质粒pGEX-2T。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。表达的融合蛋白产物经GST琼脂糖亲和层析纯化,Westem-blotting鉴定。融合蛋白GST-PⅠ与人乳腺癌细胞MBA-MB-231等不同乳腺癌细胞共育培养,免疫荧光检测特异性小肽PⅠ介导GST蛋白进入细胞的能力。结果:筛选出进入MDA-MB-231细胞的小肽噬菌体;小肽噬菌体呈现MDA-MB-231细胞亲和特异性,亲和程度高于嵌合蛋白噬菌体(RGD-integrinbinding phage)。小肽噬菌体与其他大多数肿瘤细胞及正常细胞无亲和性。20个随机挑选的噬菌体克隆检测出5条特异性的小肽序列,分别为CASPSGALRSC(PⅠ)、CFPVPGHDLVC(PⅡ)、CFSVPGHDIVC(PⅢ)、CYTYPLGWHIC(PⅣ)和CTPMSLSLSEC(PⅤ)。合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列PⅠ和PⅠ(C-)仍然保持与MDA-MB-231细胞的亲和特异性,并且亲和程度高于RGD-integrin。PⅠ(S)未进入MDA-MB-231细胞中。成功构建pGEX-2T-PⅠ和pGEX-2T-PⅠ(S)原核表达载体,并在大肠杆菌中分别表达融合蛋白GST-PⅠ和融合蛋白GST-PⅠ(S),两者经GST亲和层析,纯度达85%。免疫荧光显示GST-PⅠ进入MDA-MB-231细胞中,而未进入其他乳腺癌细胞株中。PⅠ(S)不介导GST蛋白在MDA-MB-231细胞中的跨膜转运。结论:本实验建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知小肽的技术;得到了一条能与MDA-MB-231高特异性结合,并具有携带外源性蛋白质分子靶向性进入该细胞的活性小肽,这种特异性呈现氨基酸小肽序列高度依赖性,推测与MDA-MB-231肿瘤细胞表面独特表达的膜结构有关。该小肽具有作为个体化治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值。同时,本研究为肿瘤细胞特异性抗原或抗体的研究提供理论和实验依据。