汉坦病毒（Hantavirus）可引起两种急性病毒性传染病：一种是汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一种是肾综合征出血热（hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS）。其中，HFRS在我国流行范围广，发病率高，病死率也较高；另外，HFRS的传染源和宿主动物广泛，可通过多种途径传播，其防治任务十分艰巨。但由于HFRS的发病机制较为复杂，有些环节尚未研究清楚，使临床缺乏特效治疗药物，目前使用的灭活疫苗也存在不足，因此加强汉坦病毒相关的基础研究十分必要。汉坦病毒包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）能诱导病毒与宿主细胞发生膜融合，能刺激机体产生中和抗体，对感染动物或HFRS患者有一定的保护作用，与病毒的致病性及诱发机体产生抗病毒免疫等均有密切关系，是汉坦病毒研究中最受关注的蛋白之一。汉坦病毒Gn、Gc上均存在保守的N-糖基化位点。国内外对一些病毒的研究表明，N-糖基化对糖蛋白自身的转运、折叠，对抗原决定簇的结构、功能以及对病毒颗粒的成熟、毒力和免疫逃避等均有重要作用。但目前对汉坦病毒GP糖基化的研究仍仅限于糖基化对GP本身蛋白的正确折叠及其与细胞膜融合作用的影响，而对GP糖蛋白糖链的结构、抗原性、免疫原性及对病毒感染性的影响仍不清楚。针对以上问题，本实验利用基因重组技术，对汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）76-118株GP上的N-糖基化位点分别进行突变后构建重组假病毒，利用凝集素芯片技术对各重组假病毒糖蛋白的糖链结构进行了初步分析；通过对各重组假病毒感染Vero-E6细胞能力的比较研究了糖基化位点对病毒感染性的影响；并用重组假病毒免疫小鼠，通过检测免疫小鼠的体液免疫、细胞免疫应答水平及其对HTNV感染的保护作用等，评价了糖基化位点对GP免疫原性的影响。【研究方法及结果】一、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因重组假病毒的构建及其糖链结构的比较研究1．采用定点突变的方法，分别突变了HTNV76-118株GP的5个N-糖基化位点（Gn的N134Q、N235Q、N347Q、N399Q和Gc的N928Q），分别构建了含有上述突变位点和非突变位点的真核表达载体，与包装质粒共同转染293T细胞后，获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。2．用凝集素芯片对6株重组假病毒糖蛋白糖链结构进行检测，结果显示：rLV-M与WFA、STL、BS-I、DSA、WGA5种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M1与STL、BS-I、DSA、WGA4种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M2与STL、BS-I、DSA、WGA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M3与WFA、STL、BS-I、DSA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M4与STL、BS-I、DSA3种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M5与AAL、GSL-I、STL、BS-I、DSA、BPL、NPL、PTL-II8种凝集素的结合信号为阳性。3．根据凝集素识别糖链的特异性不同，推测出不同的重组假病毒上存在有不同的糖链结构：rLV-M上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M1上主要为GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M2上主要为Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc、LacNAc和Gal糖链结构；rLV-M3上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Gal、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构； rLV-M4上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal和α-GalNAc糖链结构；rLV-M5上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、fucose、Galβ1-3GalNAc、Gal、Non-substitutedα-1,6Man和GalNAcα-Ser/Thr（Tn）糖链结构。与rLV-M相比较，rLV-M2、LV-M3、rLV-M5均增加了Gal和Non-substitutedα-1,6Man糖链结构，rLV-M5还增加了Fucose、GalNAcα-Ser/Thr（Tn）、Galβ1-3GalNAc糖链结构；而rLV-M1、rLV-M2、rLV-M4、rLV-M5均减少了GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构，rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5则都减少了Multivalent Sia、（GlcNAc）n糖链结构。4．对与所有重组假病毒结合信号均为阳性的STL、BS-I、DSA3种凝集素的荧光信号强度进行比较，结果显示：与rLV-M相比，rLV-M1与STL、BS-I、DSA3种凝集素结合的荧光信号均明显增强（P＜0.05）；rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4与BS-I结合的荧光信号明显增强（P＜0.05）；而rLV-M2、rLV-M3、 rLV-M4、rLV-M5与DSA结合的荧光信号均明显减弱（P＜0.05），其余均无明显区别。说明在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4中α-Gal和α-GalNAc糖链结构的丰度高于rLV-M，在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5中β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构的丰度低于rLV-M，而在rLV-M1中LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、β1-4GlcNAc和GlcNAc糖链结构的丰度均高于rLV-M。二、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因的重组假病毒感染性及免疫学特性比较研究1．取6株重组假病毒以相同滴度分别感染Vero-E6细胞后，荧光显微镜下可见各株重组假病毒感染的细胞均有明显的绿色荧光。进一步用流式细胞仪对感染细胞进行GFP检测，结果显示：rLV-M株的GFP阳性细胞含量为57.2%；rLV-M3株为66.4%，比rLV-M株增加了约10%的感染性；rLV-M1株和rLV-M2株分别为45.9%和48.5%，均比rLV-M株降低了约10%的感染性；rLV-M4株为38.5%，比rLV-M株降低了约20%的感染性；rLV-M5株最低，为28.1%，比rLV-M株降低了约50%的感染性。结合前述糖链结构检测结果进一步分析后提示，改变的糖链结构可能影响了GP上病毒吸附蛋白（VAP）的构象或糖蛋白本身的正确折叠，从而引起病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是感染性高低的重要决定因素之一。2．将6株组重组假病毒通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，以空载体、生理盐水及HFRS灭活疫苗为对照，通过ELISA及微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。ELISA结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出抗HTNV GP的特异性抗体，其几何平均滴度（GMT）分别为134.5、123.4、134.5、134.5、123.4和134.5，各组间无显著差异（P＞0.05）；灭活疫苗对照组小鼠血清中抗GP抗体的GMT为146.7，与各实验组间亦无显著差异（P＞0.05）。微量细胞培养中和试验结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出中和抗体，其GMT分别为103.8、103.8、95.1、113.1、95.1和87.2，各组间无显著差异（P＞0.05），但均高于GMT为16.8的灭活疫苗对照组（P＜0.05）。3．通过ELISPOT的方法对各组免疫小鼠脾细胞分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平进行了检测。结果表明，各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平均无显著差异（P＞0.05），且均高于生理盐水对照组小鼠（P＜0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2的水平均低于灭活疫苗对照组小鼠（P＜0.05），而与rLV-ZsGreen对照组小鼠无显著差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌IL-4、IL-10的水平与疫苗对照组之间无显著差异（P＞0.05），且均高于rLV-ZsGreen对照组小鼠（P＜0.05）。细胞因子检测结果表明，所有含HTNV GP的重组假病毒均可刺激小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-10水平增高，而分泌INF-γ、IL-2水平与rLV-ZsGreen对照组无明显的差别，提示含HTNV GP的重组假病毒作为免疫原诱导宿主体内产生了以体液免疫为主的应答，且突变株与非突变株重组假病毒之间没有明显的差异。4．用HTNV76-118病毒株对上述各组免疫的C57BL/6小鼠进行病毒攻击后，ELISA双抗体夹心法对各组小鼠肝脏和脾脏中HTNV抗原检测结果表明，与rLV-ZsGreen对照组和生理盐水对照组相比，采用各重组假病毒免疫小鼠，对HTNV的感染均有一定的保护作用（P＜0.05），而各重组假病毒组之间的保护作用无显著差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组对小鼠的保护作用均弱于灭活疫苗免疫组（P＜0.05）。【结论】本研究采用定点突变的方法，成功获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。凝集素芯片检测结果表明，HTNV Gn及Gc上每一个糖基化位点的变化均引起了重组假病毒自身糖链结构的改变；进一步结合感染性检测结果分析提示，改变的糖链结构可能影响了HTNV GP上VAP的构象或糖蛋白本身的正确折叠，从而引起重组假病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，重组假病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是重组假病毒感染性高低的重要决定因素之一，提示通过限制或修饰该糖链结构很可能影响重组假病毒对靶细胞的感染性，从而为HTNV的防治提供新的靶向分子。动物实验结果显示，所有含HTNV GP的重组假病毒免疫的小鼠均可以引起体液免疫为主的HTNV特异性免疫应答，能够产生较高滴度的中和抗体且对小鼠感染HTNV有一定的保护作用。但由于改变的糖链结构可能没有位于HTNV主要抗原表位的附近，或突变单个糖基化位点引起的糖链结构的改变对抗原表位的整体空间结构影响不大，因此单个糖基化位点的突变对GP的免疫原性并没有明显的影响。此外，构建的含有HTNV GP的重组假病毒能够诱导机体产生较高滴度的中和抗体，也为我们进一步优化汉坦病毒基因工程疫苗的设计提供了良好的思路和实验依据。