病毒感染在世界范围内危害着人类的健康,可以导致各种急性慢性疾病,甚至死亡。感染人类的病毒主要是DNA或RNA病毒,如EB病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒等。目前普遍的治疗方法是抗病毒治疗,而抗病毒治疗的决策、用药的剂量、疾病的预后等的重要依据是病毒载量检测。病毒载量检测的金标准是病毒核酸的定量检测(quantitative nucleic acid testing, NAT),目前常用的是荧光定量PCR检测方法。然而,标本中的病毒核酸在不恰当的采集、运送、保存和处理的情况下具有不稳定性,若用目前现有的商品化试剂盒的核酸定量检测方法检测,病毒核酸的不稳定性将导致其检测效率降低,甚至出现假阴性结果。我们的目标是建立一种方法,做到即使在病毒核酸不稳定时,仍能尽可能地检出患者体内原始的病毒载量,以此来克服核酸不稳定性对病毒载量检测和抗病毒治疗造成的影响。由于HCV RNA是典型的具有不稳定性的病毒核酸,本文以此作为研究对象。本文基于HCV RNA的降解机制,发展了一种新的引物设计策略,即除了秉承经典的引物设计原则中引物设计在保守区外,还提出了引物设计要避开酶切位点,使目的片段的长度尽可能短的策略,从而降低模板被酶切降解的几率。基于该引物设计策略,我们建立了一种新的HCV RNA逆转录荧光定量PCR (reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)方法。本方法包括了HCV RNA的引物探针设计、核酸提取和核酸扩增三大步骤。RNA的引物探针根据本文的引物设计策略进行设计；RNA提取采用的是QIAGEN的RNA提取方法,但不同的是所用的提取柱是MiRcute,该提取柱能吸附甚至<100m的RNA片段；RNA的扩增用的是自建的优化后体系和反应条件,对RNA进行一步法的逆转录和扩增。为验证新的提取方法(MiRcute提取柱)的优势,我们将其与QIAGEN的RNA提取方法进行比较,同时提取降解的HCV RNA样本后扩增,比较检测的病毒载量。为验证新的RT-qPCR方法的性能,对RT-qPCR进行了方法学性能评价,包括线性、最低检出限(limit of detection, LOD)、灵敏度、特异性以及和商品化试剂盒检测的一致性。为验证其临床实用性,我们对RT-qPCR方法进行了临床标本检测,并与CAP/CTM(?)和KeHua(?)对相同临床标本的检测结果进行了统计学比较。为验证引物设计策略的正确性,我们另外设计了3对引物,扩增依次延长的目的片段,并将这3对引物与本方法中根据设计原则设计的引物进行统计学比较。结果显示,第一,新的提取方法(MiRcute提取柱)比QIAGEN的RNA提取方法更有优势,具有统计学差异(p<0.037)。说明新的提取方法能够吸附更多的降解的HCV RNA小片段,从而提高了扩增效率。第二,新的RT-qPCR方法具有很好的方法学检测性能：线性R2=0.99；最低检出限LOD为46.06 IU/mL (40.65-54.07 IU/mL,95%置信区间)；灵敏度的批内变异系数(coefficient of variation, CV)为0.93%-1.34%,批间变异系数CV为1.06%-3.34%；具有100%的特异性；与商品化试剂盒CAP/CTM(?)检测的样本具有高度相关性(R=0.957)。第三,新的RT-qPCR方法具有良好的临床实用性。在病毒核酸稳定时,本文方法与商品化试剂盒CAP/CTM(?)和KeHua(?)对临床样本的检测没有统计学差异(p>0.05)；而当病毒核酸不稳定时,本文方法与商品化试剂盒CAP/CTM(?)和KeHua(?)对临床样本的检测相比,有统计学差异(p<0.05),此时CAP/CTM(?)和KeHua(?)对不稳定病毒核酸的检测值都比稳定时有所下降(其中以KeHua(?)下降的更多),而本文新的RT-qPCR方法在降解后的检测值与降解前比没有统计学差异,仍然能最大限度地反映降解前患者血清中的病毒载量。第四,实验证明了新引物设计策略的正确性。在RNA降解样本中,随着目的片段的延长,RNA的扩增效率下降,即扩增效率62-bp>157-bp>222-bp>304-bp,目的片段越短、避开酶切位点,被酶切降解的几率越小。我们创新性地将二级结构和酶切位点考虑到引物设计原则中,建立了新的引物设计策略。并且利用此策略成功地建立了一种新的RT-qPCR方法。该方法克服了由于标本采集、运输、保存、处理不当导致的商品化试剂盒检测效率降低的弊端,即使在病毒核酸不稳定的情况下,依然能最大限度地反映出其原始病毒载量,从而为临床对HCV的诊断、治疗、预后提供准确依据。同时,由于病毒核酸中都有二级结构和酶切位点,新的引物设计策略也可以应用于其他RNA或DNA病毒的检测中,为开发其他病毒的新型检测方法奠定了基础。