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锰过氧化物酶(]manganese peroxidase, MnP)是一种真菌分泌的含有铁血红素的糖基化过氧化物酶,在H2O2与Mn2+同时存在时,能够氧化分解芳香环多聚体等多种难降解化合物,被认为是木质素降解的关键酶之一。近年来,由于其在芳香族污染物脱毒、染料脱色等方面的潜在应用价值,已成为了食品工业、造纸工业、环境保护等领域中的研究热点。裂褶菌F17是本实验室自主分离保存的一株产锰过氧化物酶的白腐真菌,在其产酶条件、脱色能力及酶的分离纯化等方面已有了不少研究,但对于该菌锰过氧化物酶的基因克隆与表达的研究还相对较少。本文通过提取裂褶菌F17总DNA及RNA等途径,克隆了锰过氧化物酶的保守列基因,并对其序列进行初步分析,研究内容及结果如下：裂褶菌F17总DNA的提取：本实验分别使用蜗牛酶法及试剂盒法对裂褶菌F17的新鲜菌丝与冻干菌丝进行总DNA提取,并对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱检测。通过对提取的总DNA实验操作过程、DNA浓度、纯度以及完整性等方面进行比较与分析,得出蜗牛酶法提取冻干菌丝效果为最佳：DNA完整性较好,A260/A280比值处于1.8～2.0之间,‘纯度较高,浓度可达0.90ug/ul,且菌体不需液氮研磨就可以降解细胞壁,破裂细胞膜,操作时间短,效率高,设备简单,成本较低。裂褶菌F17总RNA的提取：本实验有目的的选择了Trizol试剂盒法、硅藻土-STE法、CTAB-LiCl法对裂褶菌F17进行总RNA的提取,并对提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱检测。通过对提取的总RNA实验操作过程、浓度、纯度以及完整性等方面的比较与分析,得出硅藻土-STE法是总RNA提取的最佳方法：提取的RNA中28SrRNA与18SrRNA的条带非常清晰,同时可清楚观察到5.8S rRNA,A260/A280的比值介于1.7～2.0之间,A260/A230的比值大于2.0,且浓度高达1.102ug/ul;而TRIZOL试剂盒法提取的RNA降解明显,泳道模糊不清；CTAB-LiCl法所得RNA浓度太低。且对沉淀RNA这一步骤进行改良,在LiCl-无水乙醇共沉淀后,又采用NaAc和无水乙醇再次沉淀RNA,以除去高含量的多糖,得到了高质量的、完整的RNA。锰过氧化物酶基因片段的克隆与分析：根据序列比对软件Clustal2.0及相关文献设计了7对用于简并PCR的引物,以裂褶菌F17总DNA为模板,通过引物P(上游：5’GGHGGTGCCGATGGSTC3’,下游,5’TCRGACTGGAGSCGCATC3’)扩增到一个745bp的基因片段,据此段序列设计特异性引物,通过内含子剪切法最终扩增得到一个590bp的片段：AT含量为47.46%,GC含量为52.54%。经Blast比对,此段显示出与其他白腐真菌MnP氨基酸序列较高的相似度,与拟蜡菌Ceriporiopsis sp. MD-1的MD基因(Accession No.:AB362389.1)基因同源性评价最高,达88%。预测出的196个氨基酸残基,表现出了植物过氧化物酶家族的特征,包含了木质素过氧化物酶系Mn2+、Ca2+及血红素结合位点。