论文部分内容阅读
植物在遭受病虫害等生物胁迫时,外界的胁迫信号可以通过信号传导途径传递到植物细胞内,激活抗逆相关基因的表达。MAPK蛋白激酶广泛参与植物对胁迫信号的传递,是调控植物抗性的关键基因。近年来,随着CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated Protein)系统的快速发展,该技术被广泛应用于生物学研究和应用中。而在基因组编辑的实践中,g RNA的表达是CRISPR技术的难点之一。为了构建更加高效的CRISPR载体用于作物的抗病等研究,我们创建了一种新的方法来表达CRISPR/Cas9技术所需的g RNA和Cas9两个元件。本研究验证了该方法能够高效率的同时编辑多个水稻基因,并获得了抗病相关基因的靶向突变材料,取得的主要结果如下。(1)序列分析结果表明,本实验室前期构建CRISPR载体所用的水稻UBI10(Ubiquitin10)基因的启动子的5’-UTR(untranslated region)包含了一个内含子,该内含子具有典型的5’-GU-A-AG-3’的剪接序列。通过改造UBI10基因的启动子,构建了p RGEB33和p RGEB34用于表达含t RNA-g RNA内含子(intronic polycistron of t RNA-g RNA,in PTG)和Cas9的融合基因(in PTG-Cas9)。(2)水稻原生质体的实验结果表明,将串联polycistronic t RNA-g RNA(PTG)的片段克隆到Cas9的内含子时对蛋白表达有一定影响,但对内含子的正常剪接无影响。(3)通过对三个MAPK(Mitogen-activated protein kinase)基因和PDS(phytoene desaturase)基因进行靶向突变实验表明,in PTG-Cas9载体能高效率的靶向编辑2-4个位点。(4)为了测试内含子的位置对编辑效率的影响,本研究构建了内含子位于3’-UTR的in PTG和Cas9融合表达的载体。水稻原生质体中的实验结果表明,与5’-UTR比较,3’-UTR表达in PTG能提高编辑效率。(5)通过农杆菌转化获得in PTG-Cas9稳定转化植株,结果表明,in PTG-Cas9载体能高效率地同时编辑多个靶位点,而且这些突变均能遗传到T1代。(6)通过in PTG-Cas9技术,获得了MPK1、MPK5和PDS的单基因突变材料,以及MPK1和MPK5双基因的突变材料。对所获得的MAPK功能敲除材料进行稻瘟菌接种实验和根结线虫侵染实验。结果表明,MPK1和MPK5功能敲除的基因编辑水稻的抗病性下降。综上所述,本研究开发了一种新型的内含子表达CRISPR技术所需g RNA的技术,利用该技术可把Cas9和多个g RNA用一个融合基因表达。在开发CRISPR技术的过程中,本研究还获得了两个MAPK基因的靶向编辑的水稻,并初步分析了这两个材料的抗性。MAPK是植物抗病信号通路以及抗逆、激素、发育等信号通路的调控枢纽,因此这些材料也有助于进一步阐明抗病与其他信号通路交互作用的机制。