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维生素D是通过与骨,甲状旁腺,肾脏和胃肠道的相互作用调节钙稳态,已经被用来作为糖尿病肾病(DKD)的常规用药。几个临床试验表明,维生素D在糖尿病肾病的治疗中,存在着减少蛋白尿和减缓肾损伤的抗炎作用,但其作用机制尚不清楚。而晚期糖化终产物(AGEs)在血浆和肾的积累,在糖尿病肾病中,是大家公认的促炎症分子。为了探索这种抗炎作用,我们设计实验。 研究目的:探寻骨化三醇减少AGEs引起的人肾系膜细胞炎症反应的机制,具体是探寻骨化三醇对AGEs引起的人系膜细胞表达白细胞介素-6(IL-6)和单核细胞趋化因子(MCP-1)和对AGE-RAGE-ROS-NF-κB信号通路的影响。 研究方法:通过体外制备AGE-HSA和培养人肾脏系膜细胞,在明确AGE-HSA时间依赖和浓度依赖下引起肾脏系膜细胞炎症反应后,使用或不使用骨化三醇进行干预,使用ELISA检测IL-6和MCP-1细胞上清中蛋白的表达,免疫蛋白印迹检测VDR、RAGE、核转位因子-κB的蛋白表达;实时定量-PCR检测IL-6、MCP-1、VDR、RAGE的mRNA的表达;流式细胞技术检测活性氧(ROS)的表达,免疫荧光法检测活性氧的表达和核转位因子-κB的核转位水平。 实验结果:在培养的人肾小球系膜细胞中, (1) AGE-HSA以剂量和时间依赖的方式上调IL-6和MCP-1表达(与对照组相比,P<0.05),而骨化三醇则以剂量依赖的方式抑制AGE-HSA诱导IL-6和MCP-1表达(与剂量0组比,P<0.05); (2)单独以AGE-HSA处理的细胞中与对照组相比,维生素D受体的表达没有明显的差异(P>0.05),而用骨化三醇处理的细胞中,维生素D受体的表达随骨化三醇浓度增加而增加(与对照组比,P<0.05); (3)AGE-HSA以时间依赖的方式上调IL-6和MCP-1表达(与对照组相比,P<0.05),骨化三醇通过剂量依赖的方式抑制RAGE的表达(P<0.05); (4)单独使用AGE-HSA处理细胞时,ROS表达显著增加,而在加入骨化三醇后,随骨化三醇浓度的增加,ROS的生成显著下降(P<0.05)。 (5)在AGE-HSA刺激后5分钟后,磷酸化NF-κB亚基p65的表达开始增加,而这种磷酸化表达将在AGE-HSA刺激后30分钟达到最大值(与对照组相比,P<0.05);在加入骨化三醇后,磷酸化NF-κB亚基p65的活化被以剂量依赖的方式逐渐降低(与AGE-HSA组相比,P<0.05)。 实验结论:在人肾小球系膜细胞中,骨化三醇可以通过结合并活化维生素D受体,减缓AGE-HSA引起RAGE表达和ROS的产生、抑制NF-κB的活化,进而减少AGE-HSA引起的人肾系膜细胞表达IL-6和MCP-1。