核黄素通过生物合成与代谢途径上的多个环节来影响植物生长发育和抗病防卫反应，特别是对植物系统性获得抗性(systemacquiredrestance，SAR)发生调控作用。生长素调控植物生长发育的不同过程，通过抑制SAR抑制植物对病原物的抗性。本博士论文通过三项研究，试验解析核黄素与生长素对SAR调控呈现相反作用的分子机理。首先，把水稻(Oryzasativa)中催化核黄素合成反应过程最后一步的核黄素合酶(riboflavinsynthase，RS)与倒数第二步的2，4-二氧四氢喋啶合酶(lumazinesynthase，LS)引入烟草(Nicotianatobacum)，它们在烟草中异源表达以后，导致核黄素含量升高，烟草生长加快，抗病性增强。其次，通过对烟草体细胞无性系变异产生的组成性表达SAR的烟草突变体ces1-1的研究，发现生长素和生长素抑制蛋白NtAPR1对调控烟草的生长和防卫都起重要作用。然后，通过T-DNA插入，产生了烟草突变体121-3，鉴定结果显示其生长性状不变，但抗病性增强，说明调控抗病性的某个基因受到了影响。这些研究结果初步解析了核黄素与生长素交叉调控植物生长与抗病防卫反应的机制，下面分别加以简介。　　1.烟草表达水稻RS基因对生长与抗病性的影响　　核黄素合酶(RS)催化核黄素合成过程的最后一步，对核黄素合成起决定性的作用。细菌和酵母很多的RS基因得到克隆，植物上研究甚少。本实验室克隆的水稻RS基因，与其他一些生物中已克隆到的RS基因在核苷酸序列和氨基酸序列上都没有同源性。为了深入了解在植物体内RS所发挥的功能，我们将水稻的RS基因在烟草体内异源表达，获得了转基因烟草(RSETT)，表达RS的转基因烟草(RSETT)生长加快，生长相关基因NtEXP1、NtEXP2表达水平升高，对TMV的抗性增强。抗病防卫相关基因PR-1a、PR-1b的检测结果显示，在RSETT中PR-1a，PR-1b的表达显著增强，与其抗病表型相一致。接种TMV于不同时间点取烟草叶片检测其活性氧，结果显示随时间增加WT烟草活性氧产生量大于RSETT烟草，表明水稻RS削弱了烟草积累活性氧(ROS)的能力，检测过敏性细胞死亡(PCD)标志性基因hin1和hsr203，与野生型烟草中的表达量相比，二者在转基因的烟草中表达较弱。另外，测定了RSETT内源黄素(Flavins)(游离态核黄素、FMN和FAD)含量，以及乙烯（ET)的释放量，其产量均高于WT植株。同时，检测乙烯信号通路中的相关基因ETR1，CTR1，ERF1，结果，RSETT的乙烯信号增强。　　2.烟草表达水稻LS基因对生长与SAR的影响　　2，4-二氧四氢喋啶合酶(LS)是生物体内合成核黄素的关键催化酶，催化合成途径倒数第二步反应，决定着生物体内的核黄素的含量。核黄素是一种多功能性的维生素，对动植物、微生物的生长发育以及抗病防卫反应都具有很重要的作用。本实验室从水稻中克隆到的LS基因，与高等植物的LS基因同源性较高。研究将水稻LS基因转入烟草，获得异源表达LS的转基因烟草(LSETT)。同野生型烟草(WT)相比，LSETT生长加快，相关基因NtEXP1、NtEXP2表达量升高，对烟草花叶病毒病(tobaccomosaicvirus,TMV)、空茎病菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovor，Pcc)及烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)的抗性增强，抗病防卫相关基因PR-1a、PR-1b、NPR1和GST1的表达均显著增强。使用DAB染色的方法检测烟草叶片中的活性氧，随时间增长，LSETT体内活性氧积累量低于WT。检测转基因烟草中细胞死亡情况，发现LSEST与WT无差异，PCD标志基因hin1和hsr203表达与其表型一致。测定LSETT和WT中黄素(游离态核黄素、FMN和FAD)含量，结果显示核黄素含量在转基因烟草中显著升高。此外，为了研究水稻LS如何参与调控烟草抗病性，以及通过何种信号通路实现，我们测定乙烯、茉莉酸（JA）含量，发现LSETT体内乙烯、茉莉酸含量显著高于野生型。进一步检测了乙烯、茉莉信号传导通路五个关键性标志基因的表达，结果显示转基因烟草的这两个信号表现增强。　　3.生长素对烟草SAR的调控作用　　生长素(Auxin)在植物的整个生命周期中自始至终发挥着调节作用，生长素信号通路与其它植物激素通路相交叉，以确保植物体正常的生长发育。为了研究生长素对植物生长与SAR的交叉调控作用，本实验室对野生型烟草进行体细胞无性系变异处理，得到了组成性表达系统性获得抗性的烟草突变体ces1-1。本研究对此烟草突变体进行深入研究，ces1-1表现生长缓慢植株矮化，不能表达与生长途径相关的NtEXP1和NtEXP2基因，而对病原菌的抗性增强，防卫反应基因PR-1a，Chia5，hin1和hsr203组成性表达。突变体ces1-1与野生型WT烟草的RNA差异显示分析，相差一个与编码生长素抑制蛋白的基因(NtARP1)一致的转录本，WT中该基因不转录。利用cDNA末端快速扩增的方法克隆到ces1-1中的NtARP1基因，生长素处理，ces1-1的NtARP1表达和蛋白产生受到抑制，亚细胞定位检测，发现NtARP1定位于突变体ces1-1的细胞核上。利用病毒介导的RNAi的方法将NtARP1沉默，ces1-1生长和抗病防卫反应表型特征均恢复到野生型水平，表明NtARP1在调控烟草的生长防卫过程中发挥着重要作用。检测ces1-1内源生长素含量，发现其含量低于野生型，外部施用生长素，则含量恢复到野生型水平，并且可以使ces1-1无论生长表型，还是组成性SAR的表型均恢复到野生型状态。这些结果表明，生长素既影响植物生长，也影响抗病防卫反应能力，应该存在一个生长素的信号通路，对于调控植物生长和调控植物防卫呈现拮抗效果。　　4.烟草抗病性突变体121-3的特性与突变基因分析　　农杆菌介导T-DNA插入植物基因组产生突变体的技术，对于突变体研究以及基因功能鉴定极为有效，这种技术在拟南芥、烟草、水稻等植物研究中得到了广泛应用，并建立起许多T-DNA标签插入突变体库。本研究对使用T-DNA插入获得的表现组成性SAR的烟草突变体121-3及其突变基因NtTIA进行分析研究。突变体121-3表现表型无变异，抗病性显著增强。可见，T-DNA的插入改变了烟草体内与抗病相关的基因表达，激活了抗病防卫反应。通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)，得到T-DNA的右边界（RB）旁侧植物基因组DNA序列(281bp)，初步确定了T-DNA在烟草基因组中的插入位置。该DNA序列在突变体中被激活表达，断定其是与突变体抗病性改变相关的功能片段，我们将这段序列命名为NtTIA。为得到NtTIA完整的开放阅读框(ORF)，采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法扩增NtTIA的3端和5端的表达序列，结果在其3端最终得到1230bp的片段，是烟草基因组序列，而5端扩增到的则是载体上T-DNA区域的序列，这与T-DNA插入原理是一致的。对NtTIA对于烟草抗病性调控作用进行研究，NtTIA在121-3突变体中组成性转录表达。病原菌侵染诱导NtTIA表达增强，可见，NtTIA与突变体抗病性密切相关。而它是通过何种途径来调控烟草抗病性，与哪种信号通路相关？我们对其施用激素SA、JA、ET、IAA和ABA分别处理，发现在野生型烟草中NtTIA依然没有转录表达，而在121-3突变体中，SA诱导NtTIA表达减弱，JA诱导NtTIA表达增强，推断NtTIA可能参与SA和JA信号传导通路中的抗病防卫机制，有待于进一步的研究。　　结论　　第一，水稻RS在烟草体内异源表达后，影响乙烯与ROS信号传导，交叉调控烟草生长与抗病性。第二，水稻LS在烟草体内异源表达后，影响乙烯、茉莉酸与ROS信号传导，交叉调控烟草生长与抗病性。第三，生长素抑制蛋白NtARP1决定烟草SAR组成型的表达，生长素能够逆转NtARP1的作用。第四，T-DNA插入产生一个组成性表达SAR的烟草突变体121-3，其基因NtTIA受茉莉酸诱导，受水杨酸抑制，但与生长素无关。这四方面的研究结果说明，烟草生长与防卫反应的交叉调控，涉及核黄素与生长素以及其他激素的交互作用。