鹅圆环病毒(Goose Circovirus,GoCV)是近年来发现的圆环病毒科的一个新成员,常潜伏感染,侵染淋巴细胞等增殖速度快的细胞,引起免疫力下降,导致动物对多种条件性致病菌的二次感染易感性增加。2005年本实验室从浙江永康禽流感病死鹅样品中检测到GoCV,并初步分析了浙江省GoCV的分子流行病情况。但现有采用PCR扩增检测的分子流行病学检测方法操作不够简便,特别是较灵敏的检测方法需要通过采集鹅法氏囊组织来制备DNA模板,再进行PCR检测。为调查GoCV的流行情况和感染范围,以及更好地开展GoCV的致病性和免疫机制的研究,本试验开展了GoCV血清抗体检测方法的研究。　　 将本实验室已构建的能融合表达重组GoCV外壳蛋白(△Cap)的质粒pET-28a-△Cap转化到BL21(DE3),用IPTG诱导表达,优化表达条件。菌体大量培养后,经超声裂解,以包涵体形式表达目的蛋白经洗涤纯化,除去了大多数菌体杂蛋白。包涵体用8M尿素溶解,镍琼脂凝胶柱纯化,SDS-PAGE电泳分析,获得的蛋白纯度达95％以上。将纯化后的变性蛋白直接透析复性,复性率很低(＜10％)。通过不同复性条件的摸索,往变性蛋白和复性液中添加0.3％十二烷基肌氨酸钠(SKL)后,先透析去除尿素再透析去除SKL,目的蛋白成功获得高效复性。　　 为获得酶标抗鹅二抗,将用鹅卵黄IgY免疫的兔高免血清,通过辛酸-硫酸铵法进行纯化,经SDS-PAGE电泳检测,纯化的兔IgG其纯度可用于酶标抗体的制备。用HRP-简易过碘酸钠法进行标记,并对酶标产物进行特异性检测。制备的抗鹅二抗不但能与鹅血清蛋白结合还能同其它禽类血清蛋白发生交叉反应,而与哺乳动物(鼠、兔、猪等)血清蛋白不存在明显交叉反应。因此我们设想抗鸡IgG是否也与鹅血清蛋白交叉反应并用于鹅血清抗体的检测。通过直接ELISA及分别用自制的兔抗鹅二抗与羊抗鸡二抗对同一鹅群大肠杆菌抗体检测试验,确定商品化的羊抗鸡二抗可用于鹅血清抗体检测。　　 用纯化复性的△Cap蛋白为包被抗原,羊抗鸡酶标抗体为二抗,建立GoCV血清抗体的间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度及各步骤作用时间等的试验,确定重组抗原最适包被浓度为2.05μg/ml,最佳封闭液为5％脱脂奶粉,待测血清稀释度为1∶50,反应时间为37℃,1.5h,底物室温显色10min。对38份阴性血清的测定,确定阴阳性临界值OD492的值为0.25。包被的重组蛋白不与大肠杆菌、小鹅瘟、鹅副粘病毒病等阳性标准血清反应,表明建立的间接ELISA对GoCV抗体具有很好的特异性。板内和板间重复性试验结果为,同1份血清各孔间的变异系数均小于10％,表明本方法的重复性良好。利用建立好的间接ELISA方法,对浙江七个地区的20个不同鹅群共268份血清进行检测,阳性率达35.4％(95/268),初步了解了浙江地区GoCV血清流行病情况。