创面愈合是一个组织缺损修复的复杂过程,异常的创面愈合会导致慢性难愈性创面和瘢痕增生。糖尿病患者和长期卧床患者经常出现慢性难愈性创面,是临床上常见的和需要解决的难题。瘢痕疙瘩是一种特殊类型的病理性瘢痕,影响患者的功能和外观,治疗后经常复发,难以成功防治。角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor, KGF)是一种上皮细胞特异性的多功能的生长因子,由间质细胞产生,通过旁分泌机制分泌,与上皮创面愈合、胚胎发育、肿瘤的形成与发展及免疫重建等方面关系密切。发生创伤时,创面下的成纤维细胞分泌KGF, KGF促进角质化细胞增殖、迁移,以及细胞骨架重排,显著影响上皮的创伤修复过程。然而,KGF的致瘤性限制了其广泛应用。转化生长因子(Transforming growth factor-p1, TGF-p1)是目前已知的与瘢痕形成关系最密切、最具代表性的促细胞分裂诱导剂,是最强的纤维化促进因子。TGF-p1能够促进血管化,诱导肉芽组织形成,刺激细胞外基质蛋白合成和沉积,同时抑制胶原酶产生,促进伤口纤维化。相对于正常皮肤,瘢痕疙瘩高表达TGF-p1。TGF-p1通过TGF-p1信号通路影响瘢痕的形成,TβRII、Smad、MAPK. NF-kappa B和CTGF是TGF-p1信号通路的重要的细胞内介质,通过调整TGF-p1信号通路可以达到防治瘢痕增生的目的,是目前的研究热点,具有很好的研究及应用前景。噬菌体展示肽库技术是以单克隆抗体或者细胞为靶,筛选模拟性抗原表位和配体的技术,该技术已在受体阻断剂和激动剂的获得,多肽疫苗的辅助设计,多肽靶向药物的开发等多个领域得到广泛应用。噬菌体M13是一种较好的生长因子载体,具有低免疫源性、易扩散性、以融合蛋白的形式稳定表达外源多肽、并能帮助外源多肽抵抗创面复杂环境的影响等优点。为此,本研究从噬菌体随机肽库中筛选获得KGF和TGF-p1的噬菌体模拟肽；检测KGF噬菌体模拟肽对表皮细胞增殖的影响,并根据序列分析和离体细胞试验结果,选择KGF的特异性序列,构建表达pComb3-KGF活性肽,用于促进创面愈合；检测TGF-p1噬菌体模拟肽对瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性的影响,挑选具有竞争性抑制作用的噬菌体模拟肽,用于防治瘢痕增生。关于此方面的研究尚未见文献报道。第一部分KGF噬菌体模拟肽的筛选及促进表皮细胞增殖的研究目的应用噬菌体随机7肽库生物淘选具有促进表皮细胞增殖作用的KGF噬菌体模拟肽。方法以KGF单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机7肽库,测定噬菌体的滴度,计算噬菌体的回收率；4轮生物淘选后,随机挑取单克隆噬菌体,进行ELISA检测,选择结合活性较好的单克隆噬菌体,对模拟肽的DNA序列进行测序,分析序列的相似性；应用MTT方法检测噬菌体模拟肽促进表皮细胞增殖的作用；应用免疫荧光方法鉴定噬菌体模拟肽的细胞亲和力；应用RT-PCR方法检测噬菌体模拟肽组及对照组中的KGFR、人β-防御素3、c-Fos和c-Jun的表达水平。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,从噬菌体随机7肽库中筛选获得了25种噬菌体模拟肽,ELISA结果显示部分噬菌体模拟肽具有较好的特异性；MTT结果显示4种噬菌体模拟肽能够促进表皮细胞增殖；免疫荧光鉴定结果显示能够促进表皮细胞增殖的噬菌体模拟肽具有较好的细胞亲和力；RT-PCR结果显示KGFR和人β-防御素3在KGF对照组和2种噬菌体模拟肽组中高表达,c-Fos和c-Jun在KGF对照组中高表达,而在噬菌体模拟肽组中表达不增加。结论从噬菌体随机7肽库中生物淘选到了KGF噬菌体模拟肽,能够显著促进表皮细胞增殖；2种噬菌体模拟肽能够促进人β-防御素3的表达,有助于控制创面感染；噬菌体模拟肽不会促进肿瘤基因c-Fos和c-Jun的表达,安全性较好。第二部分pComb3-KGF活性肽的构建及促进表皮细胞增殖的研究目的依据前述噬菌体生物淘选和离体细胞试验的结果,选择特异性的KGF序列,构建展示pComb3-KGF活性肽,检测其促进表皮细胞增殖的作用。方法以噬菌粒pComb3为载体,选取载体的重链作为基因插入位置,以SpeI和XhoI作为限制性内切酶。依据生物淘选和离体试验的结果,选取4个序列,设计引物；应用组织块培养法培养获得人皮肤真皮的成纤维细胞,提取人成纤维细胞总RNA,应用RT-PCR方法获得目的基因；SpeI和XhoI双酶切目的基因及噬菌粒pComb3,将目的基因亚克隆至pComb3；应用噬菌体呈现技术,将插入的目的基因展示于噬菌体表面；抽提纯化噬菌体DNA,进行酶切、PCR和测序鉴定；应用MTT方法检测pComb3-KGF活性肽促进表皮细胞增殖的作用,应用免疫荧光方法检测pComb3-KGF活性肽的细胞亲和力,应用RT-PCR方法检测pComb3-KGF活性肽对KGFR.人β-防御素3.c-Fos和c-Jun的表达水平的影响。结果应用RT-PCR方法获得目的基因,并构建在噬菌粒pComb3中,酶切、PCR和测序结果证实目的基因已成功构建在载体中；目的基因成功表达于载体表面；MTT结果显示4种pComb3-KGF活性肽均能够促进表皮细胞增殖；免疫荧光检测结果显示其具有较好的细胞亲和力；RT-PCR结果显示KGF及两种pComb3-KGF活性肽能够促进KGFR的表达,KGF及3种pComb3-KGF活性肽能够促进人β-防御素3的表达,4种pComb3-KGF活性肽促进c-Fos和c-Jun表达的作用均弱于野生型的KGF。结论成功构建展示获得pComb3-KGF活性肽,能够显著促进表皮细胞增殖,能够促进人β-防御素3的表达,有助于控制创面感染,但促进肿瘤基因c-Fos和c-Jun的表达弱于野生型的KGF。第三部分TGF-p1噬菌体模拟肽的筛选及拮抗瘢痕疙瘩成纤维细胞活性的研究目的检测从噬菌体随机7／12肽库中生物淘选的TGF-β1噬菌体模拟肽对瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性的影响,评估其拮抗瘢痕疙瘩成纤维细胞活性的作用。方法以人TGF-p1单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机7／12肽库,期望获得包含类似于TGF-p1的外源性模拟肽的噬菌体模拟肽；随机挑取单克隆噬菌体,进行ELISA检测,对结合活性较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并进行序列分析；应用MTT方法评估噬菌体模拟肽对正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响；应用annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测噬菌体模拟肽诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的作用；应用免疫荧光方法检测模拟肽的细胞亲和力；应用RT-PCR方法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中NF-Kappa B, CTGF和TPRII的表达水平。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,从噬菌体随机7肽库中筛选获得了4种噬菌体模拟肽,从噬菌体随机12肽库中筛选获得了10种噬菌体模拟肽；ELISA结果显示具有较好的特异性；MTT结果显示7种噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,并促进其凋亡；免疫荧光鉴定显示噬菌体模拟肽具有较好的细胞亲和力；RT-PCR结果显示7种噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中NF-Kappa B和CTGF的表达,但是部分实验组中TβRII的表达轻度升高。结论从噬菌体随机7／12肽库中生物淘选到了TGF-p1噬菌体模拟肽,7种噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,并诱导其凋亡。