雌激素作为典型激素类内分泌干扰物,可干扰机体激素代谢平衡,并影响机体生长和发育等重要生理功能。环境介质如土壤水源等是目前雌激素污染富集的重要场所,而因此间接污染食品基质是其导致危害机体健康的重要因素。动物源食品因其来源广泛,生活被需求迫切并易暴露于雌激素污染的环境介质,成为环境雌激素富集的重点对象。因此,建立食品基质尤其是动物源食品中雌激素的准确、灵敏、高效的分析检测方法尤为重要。免疫分析因具有高灵敏和高特异性等优势在食品安全检测中广泛应用,然而食品基质干扰效应是限制免疫分析在食品安全快速检测中精准和个性化应用的关键。基于此,针对特定靶标获得高亲和力、抗基质干扰的特异性识别元件是解决免疫快速检测方法稳定性和可靠性的主要工作之一。相比传统抗体,通过基因工程重组抗体技术是获得高质量抗体的重要手段。本论文以17β-雌二醇为模型,在哺乳动物细胞Expi293F中瞬时表达雌二醇抗体及抗体片段免疫识别元件;基于抗体制备雌二醇荧光定量检测试纸条,实现对牛奶中雌激素的高灵敏快速检测;通过噬菌体展示肽库结合二代测序技术,筛选特异性识别雌二醇的多肽免疫元件及雌二醇的模拟表位肽,构建基于模拟表位肽的雌二醇抗基质干扰传感器,实现对牛奶中雌二醇的高灵敏快速检测。主要研究内容和结论如下:1.雌二醇IgG、Fab、scFv抗体的表达与评价研究。从Protein Data Bank（PDB）数据库中检索获得雌二醇单克隆抗体序列信息（PDB ID:1JN6）,分别构建雌二醇IgG抗体重链、轻链表达载体pTT5-IgGH、pTT5-IgGL,雌二醇抗原结合片段Fab抗体重链表达载体pTT5-Fab H和雌二醇单链抗体scFv表达载体pTT5-scFv。将表达质粒分别按1:1.5重/轻链比例共转染哺乳动物细胞Expi293F,分别进行IgG、Fab及scFv抗体的瞬时表达。结果表明,通过30 mL的Expi293F细胞瞬时表达体系,获得雌二醇IgG抗体和Fab抗体各约800μg,表达产量约27 mg/L;基于表达的IgG和Fab抗体构建雌二醇竞争ELISA检测标准曲线IC50分别是0.129 ng/mL和0.188 ng/mL。此外,scFv抗体的上清培养基纯化电泳结果未显示目的条带,但细胞沉淀中显示scFv抗体条带,故初步分析scFv抗体聚集在胞内未分泌表达。2.荧光标记的雌二醇Fab-EGFP抗体、scFv-EGFP抗体的表达与评价研究。为进一步探究scFv抗体在表达过程中的亚细胞定位,将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为指示剂,与scFv基因连接,构建重组表达载体pTT5-scFv-EGFP。此外,为进一步探究不同表达载体对表达产量的影响,保持信号肽等其余设计不表,构建pc DNA3.4-IgGH/L和p CEP4-IgGH/L表达载体。最终,为获得荧光标记抗体,构建pTT5-Fab H-EGFP和pc DNA3.4-Fab H-EGFP表达载体。在相同条件下进行哺乳动物细胞瞬时表达scFv-EGFP、IgG、Fab-EGFP。结果表明,Fab-EGFP和scFv-EGFP荧光标记抗体更多在细胞内未分泌到培养基中;基于pc DNA3.4和p CEP4载体的IgG抗体表达产量约0.667 mg/L和7 mg/L。因此pTT5比pc DNA3.4和p CEP4更适合作为IgG全长抗体的哺乳动物瞬时表达载体。3.特异性识别雌二醇的多肽元件及其模拟表位肽的筛选方法的构建及机制研究。从数据库或文献中获得公开的抗体序列是极少数,大部分靶标分子的抗体信息是非公开的,而环境和食品中潜在高风险化学污染物数以千万,在这种情况下,如何快速获得靶标分子的特异性免疫识别元件,是当前免疫快速检测的重要工作之一。本章分别以雌二醇全抗原（E2-BSA）和雌二醇单抗（anti-E2 mAb）为靶标分子,将二代测序技术与噬菌体展示肽库传统筛选方法相结合,分别筛选获得特异性识别雌二醇的抗体肽和雌二醇分子的模拟表位肽。整个筛选过程仅需进行一轮,且不需噬菌体的扩增纯化,筛选结果的准确性和成功率大幅度提高。最终获得了能够特异性识别雌二醇的抗体肽（ASNYFEHRIHLF、SAEDHQSYTAAR、HTEIGIARLLSW）和雌二醇的模拟表位肽（KWQIWHGYFFGW、KWQIWHGYFFYW、KWQIWHGEFFGW）。4.检测牛奶中17β-雌二醇的荧光定量免疫层析试纸条的构建。免疫层析试纸条小巧便携、成本低、响应速度快,是开发现场即时检测设备的最佳载体。以抗体作为检测识别元件,基于量子点荧光微球（QBs）、重组蛋白A（SPA）和兔抗鼠IgG抗体（anti-IgG）构建的荧光探针QBs@SPA和QBs@SPA@anti-IgG作为信号供体,构建雌二醇免疫层析试纸条。探针表面固定的SPA和anti-IgG可定向识别雌二醇抗体的Fc端,将雌二醇抗体的抗原识别位点充分暴露。以游离态抗体捕获分析物,探针捕获抗体或抗体-抗原免疫复合物,随着体系中雌二醇浓度降低,荧光探针在T线富集,其荧光值越高。在优化条件下建立雌二醇浓度和浓度相对应的T/C荧光比抑制率之间的线性关系,结果显示基于所制备的两个荧光探针的E2检测范围分别在0.1–200 ng/mL和0.01–100 ng/mL,相应的IC50值分别为8.83 ng/mL和0.93 ng/mL。该体系在更换一套检测抗体和竞争抗原情况下,相同的探针同样适用于其它目标物的高灵敏检测。5.检测牛奶中17β-雌二醇的抗基质干扰多肽传感器的构建。食品中基质干扰是影响免疫检测准确度的重要因素,抗基质干扰材料是解决基质干扰效应的有效手段。将雌二醇模拟表位肽、抗基质干扰肽、刚性结构锚定肽串联组装,设计合成具有雌二醇竞争抑制功能、抗牛奶样品基质干扰功能、与金锚定形成自组装单层膜功能的“三合一”多功能肽链。应用于电化学传感检测平台,构建检测牛奶中雌二醇的电化学抗基质干扰多肽传感器。在优化条件下,雌二醇检测范围在0.5 pg/mL至1 ng/出之间,IC50为0.0159 ng/mL。通过ELISA试剂盒进行方法学验证,加标回收率在84.3±5.9%到104.1±3.3%之间,且对雌酮和雌三醇无响应信号。因此,该方法为牛奶中抗基质干扰传感器的开发提供一种新思路。