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背景和目的肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是一种综合病征,主要表现为:肝病(原发)-肺内微血管扩张(intrapulmonary microvascular dilatation,IPVD)-低氧血症,在肝硬化患者中发病率可达4-47%。HPS晚期常常伴肺动脉高压,这是各类肝脏疾病患者围术期肺部并发症的主要原因之一,也是引起围术期移植肝无功能的关键原因。目前已经证实IPVD是HPS进程中的早期核心变化,而肺血管重建(pulmonary vascular remodeling,PVR)也是HPS的主要病理机制之一。我们采用经典胆总管结扎大鼠(common bile duct ligation,CBDL)模型,发现了一个有趣现象:正常大鼠的肺微血管管壁是由一层内皮细胞有序排列而成,而HPS大鼠的肺微血管管壁异常增厚。在显微镜下取增厚的血管壁,进行原代培养和鉴定,里面有部分细胞CD34、VIII因子相关抗原检测阳性(+);部分细胞α-SM-actin染色检测阳性(+),提示组成增厚血管壁的“平滑肌样”细胞可能来自于原位的PMVECs肌样分化或异位的PASMCs;这些出现在内膜的“平滑肌样”细胞较难用单纯PMVECs肌样分化解释。细胞迁移(cell migration)是一个复杂的过程,可以被多条信号通路调节,参与血管新生、血管重塑、肿瘤转移、伤口愈合等。其次,细胞迁移与细胞膜上水通道蛋白(aquporin1,AQP1)的表达密切相关,AQP1的异常表达与分布常常伴随着细胞异常迁移。p38-MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成员之一,可以被不同的胞外刺激所激活,也是细胞迁移所需的一个关键因子。因此,本研究探讨了HPS病理进程中是否存在p38-MAPK/AQP1通路异常,引起细胞迁移参与了PVR过程。我们在拓展研究中发现,细胞极性丢失将导致无节制的细胞增殖、细胞迁移,其中,细胞极性丢失可能是HPS肺血管重建的上游关键事件。方法:实验分五部分1.构建CBDL大鼠模型采用CBDL构建HPS大鼠模型,行病理切片及血气分析(4w),制备血清。2.PASMCs的原代培养及细胞迁移的检测正常SD大鼠(7w龄,160-200g),取肺动脉主干及左右肺动脉组织行原代培养、纯化及鉴定PASMCs。随机分为2组:对照组(sham组)和CBDL实验组(CBDL组),采用transwell检测和划痕实验,分别于培养24h、48h和72h(T1、T2、T3)时,镜下观察细胞迁移情况。3.AQP1参与了CBDL大鼠血清诱导的PASMCs细胞迁移的检测在T1、T2、T3时相点,运用RT-PCR和western blot法分别检测sham组和CBDL组PASMCs中AQP1 mRNA及蛋白表达,免疫组化对大鼠肺血管中AQP1表达定位,及免疫荧光对体外培养的PASMCs中AQP1表达检测。siRNA干扰AQP1表达后,transwell检测细胞迁移改变。4.p38-MAPK参与了CBDL大鼠血清诱导的PASMCs AQP1依赖性细胞迁移的检测下调PASMCs中p38-MAPK活性,western blot法检测PASMCs中AQP1表达及transwell检测细胞迁移能力。5.细胞极性丢失参与调控HPS肺血管重建的检测(拓展研究部分)免疫荧光检测sham组和CBDL组大鼠肺血管内膜细胞极性蛋白定位改变,pull-down检测cdc42蛋白活性及F-actin染色检测细胞骨架重塑,采用transwell小室和Ki67染色检测细胞极性丢失后细胞增殖迁移情况。结果:1.CBDL大鼠血清对PASMCs细胞迁移的影响1)在倒置显微镜下观察:细胞呈长梭形、三角形,交织成网状,胞核清晰,胞浆丰富。2)与sham组比较,CBDL组PASMCs细胞迁移增加(P<0.05),且呈时间依赖性。2.AQP1参与调控PASMCs细胞迁移1)与sham组比较,CBDL组PASMCs内AQP1 m RNA及其蛋白表达增加(P<0.05),且呈时间依赖性;与sham组比较,CBDL组PASMCs中AQP1绿色荧光表达增强。2)在sham组和CBDL组中,与si Ctrl组比较,siAQP1组PASMCs细胞迁移数目减少(P<0.05),且在CBDL组中,呈时间依赖性。3.p38-MAPK参与调控PASMCs的AQP1依赖性细胞迁移1)与sham组比较,CBDL组PASMCs内p38-MAPK蛋白表达增加(P<0.05);2)与CBDL组比较,CBDL+SB203580(1、5u M)组p38-MAPK、AQP1蛋白表达减少(P<0.05),且呈剂量依赖性(0、1、5u M);并且SB203580可以有效抑制AQP1介导的细胞迁移(P<0.05)。4.细胞极性丢失参与调控HPS肺血管重建(拓展研究部分)1)肺组织免疫荧光结果显示,在sham组,细胞极性蛋白podocalyxin(PCX)主要分布于血管内膜细胞的顶端,而β-catenin分布于底-侧端;而在CBDL组,细胞极性蛋白podocalyxin和β-catenin在血管内膜细胞发生了异位,错乱分布于细胞周围。2)在体外CBDL血清培养的PMVECs,与sham组比较,CBDL组cdc42活性表达增加(P<0.05);与CBDL组比较,CBDL+casin组可以有效抑制cdc42活性表达(P<0.05)。3)与sham组比较,CBDL组PMVECs细胞骨架F-actin发生重塑,而CBDL+casin组排列紊乱的骨架恢复正常;与sham组比较,CBDL组PMVECs细胞迁移、增殖增加(P<0.05),而在CBDL+casin组细胞迁移、增殖受到抑制(P<0.05)。结论:1.CBDL大鼠血清可促进PASMCs发生细胞迁移。2.CBDL大鼠血清诱导PASMCs内AQP1 m RNA及其蛋白表达增强,干扰AQP1蛋白表达可以明显抑制PASMCs的细胞迁移,提示CBDL大鼠血清通过AQP1促进PASMCs细胞迁移。3.CBDL大鼠血清诱导PASMCs内p38-MAPK蛋白活性增强,干扰p38-MAPK蛋白活性可以明显抑制AQP1的蛋白表达及细胞迁移,提示p38-MAPK信号通路参与了PASMCs的AQP1依赖性细胞迁移,在HPS的发生发展过程起着重要作用。4.CBDL大鼠肺组织血管内膜细胞极性蛋白发生异位;在体外培养的PMVECs中,CBDL大鼠血清诱导cdc42活性表达增强和骨架重塑;抑制cdc42活性可以减少细胞增殖、迁移;提示细胞极性丢失通过cdc42激活参与了细胞增殖、迁移,伴随细胞骨架重塑,在HPS的发生发展过程起着重要作用。(拓展研究部分)