背景:脓毒症是一种病原体侵入人体血液造成的全身炎性反应综合征,严重创伤、感染、急性胰腺炎、重症肺炎是常见的诱发因素,病情严重者进一步发展成脓毒症休克、多器官功能障碍综合征,病死率高,目前已成为患者第三大致死原因。严重脓毒症和脓毒症休克会引发心肌损伤及最终的心功能不全,主要表现为心脏扩大、心肌收缩功能障碍以及左室射血分数下降。临床研究发现内毒素和炎症因子在脓毒症所致心血管损伤的致病过程中发挥了重要作用,此外,缺氧、酸中毒、低血压和低血容量、代谢紊乱、凝血功能异常以及氧化应激损伤后过氧化物产生增加,都被认为参与脓毒症期间的心脏和大血管损伤,但其确切病理生理机制目前尚不清楚。他汀类药物是一种降脂药物,主要抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶,导致胆固醇合成减少。近年来的研究结果表明,他汀类药物不仅具有降脂作用,还具有广泛的抗炎、调节细胞免疫功能等作用。鉴于脓毒症是一种炎症反应性疾病,而他汀类药物具有广泛的抗炎效果,我们推测他汀类药物可能对脓毒症所致心血管损伤具有保护作用。多个临床研究证实,磷脂酰醇-3激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI-3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,Akt)-内皮一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)信号通路是保护心肌的重要信号传导通路之一,PI3K-Akt途径激活后,活化的Akt主要通过eNOS的磷酸化促进内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)生成,而产生的NO作为信号分子发挥保护心肌和血管等重要作用。因此,他汀类药物能否通过调控PI3K-Akt-eNOS信号通路,促进NO生成,减轻炎症反应和心肌损伤,从而可能对脓毒症患者具有很好的治疗效果,目前尚缺乏这方面的临床和基础研究。目的:本研究旨在评价瑞舒伐他汀对脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的影响,同时评价瑞舒伐他汀对LPS诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激反应的影响,探索其心血管保护作用的机制,为临床脓毒症的治疗提供新的思路和策略。方法:第一部分评价瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用。SD大鼠分为对照组、LPS脓毒症组、LPS脓毒症+瑞舒伐他汀低剂量组(10mg/kg/d)和LPS脓毒症+瑞舒伐他汀高剂量组(20mg/kg/d)。脓毒症组SD大鼠给予一次性腹腔注射LPS 20mg/kg以建立脓毒症模型。对照组SD大鼠给予一次性腹腔注射等体积生理盐水后,立即给予灌胃同等体积的高压消毒双蒸水。瑞舒伐他汀治疗组:腹腔注射LPS后立即一次性口服灌胃瑞舒伐他汀(10mg/kg或20mg/kg)。(1)造模后6小时至12小时观察脓毒症大鼠生长状态并记录生存率。(2)腹腔注射LPS后3小时、6小时和9小时的SD大鼠,经心尖抽取血液标本,分离大鼠心脏,检测血浆肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肌钙蛋白I(Troponin I,cTNI)、N端前脑钠肽(N-terminal pronatriuretic peptide,NT-proBNP)和高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1protein,HMGB1)的水平。(3)分离四组大鼠的心肌组织提取RNA和蛋白,检测心肌损伤标志物ANP、BNP和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-2的表达水平。(4)超声心动图评价四组大鼠的心脏结构和功能改变。(5)Masson染色方法观察瑞舒伐他汀对心肌组织的形态学影响。(6)分离大鼠胸主动脉,进行主动脉环诱导血管内皮细胞萌芽实验以评价血管新生水平。第二部分评价瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及并探讨作用机制。(1)LPS对大鼠主动脉内皮细胞(Rat Aortic Endothelial Cells,RAOEC)活性的影响:给予不同浓度(10、100、500、1000、10000ng/ml)LPS,作用于RAOEC 24小时,采用MTT比色法测定细胞活性及抑制率,研究LPS对RAOEC的损伤作用,选择下一步实验中LPS合适浓度。(2)瑞舒伐他汀(Rosuvastatin,RSV)对LPS诱导的RAOEC活性的影响:应用不同浓度的瑞舒伐他汀预处理RAOEC 2小时,再给予1000ng/ml(1μg/ml)的LPS作用24小时,分为5组,阴性对照组、LPS组、LPS+2μM RSV组、LPS+4μM RSV组、LPS+8μM RSV组。采用MTT比色法测定细胞活性及抑制率,评价RSV对LPS诱导细胞损伤的保护作用,选择下一步实验中RSV合适浓度。(3)RSV对LPS诱导的RAOEC氧化应激指标活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)的影响:分为4组,阴性对照组、LPS(1μg/ml)组、RSV(4μM)组、LPS(1μg/ml)+RSV(4μM)组。LPS+RSV组:给予4μM的瑞舒伐他汀预处理RAOEC 2小时,和/或给予(1μg/ml)的LPS作用24小时;使用H2DCHF-DA探针测细胞内ROS产生,硫代巴比妥酸法测脂质氧化水平MDA含量;(4)LPS、RSV及Perifosine(Akt抑制剂)对大鼠主动脉内皮细胞NO生成的影响:分组及处理:1)阴性对照组:仅给予等体积培养基;2)LPS干预组:1μg/ml LPS处理24小时;3)LPS+RSV干预组:4μM RSV处理2小时,然后再用1μg/ml LPS处理24小时;4)LPS+RSV+Perifosine干预组:5μM Perifosine(Akt抑制剂)预处理细胞1小时,然后4μM RSV处理2小时,再用1μg/ml LPS处理24小时。(5)保护作用机制研究:分组及处理同第(4)NO生成分组;机制研究方面,我们通过免疫印迹法研究瑞舒伐他汀对LPS诱导的RAOEC内PI3K-Akt-eNOS信号通路磷酸化的影响。结果:第一部分瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用。1.SD大鼠腹腔注射LPS 6小时后开始出现死亡,连续观察至12小时,LPS诱导的脓毒症SD大鼠给予低剂量和高剂量的瑞舒伐他汀均能显著降低脓毒症大鼠的死亡率(12小时生存率:LPS组20%,LPS+低剂量瑞舒伐他汀组50%,LPS+高剂量瑞舒伐他汀组70%,Mantel-Cox检验P=0.0165)。2.SD大鼠给予腹腔注射LPS后3小时、6小时和9小时,检测血浆中cTNI、NT-proBNP的水平,发现LPS诱导后血浆cTNI和NT-proBNP水平逐渐升高,6小时到达高峰(P<0.05);3.比较三组LPS诱导6小时后的脓毒症大鼠的血浆cTNI和NT-proBNP水平,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显著降低cTNI和NT-proBNP水平(P<0.05)。4.比较三组LPS诱导6小时后的脓毒症大鼠血浆中TNF-α、IL-6和HMGB1的水平,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显著降低血浆TNF-α、IL-6和HMGB1的水平(P<0.05)。5.在脓毒症诱导的心肌组织中,给予低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显著降低心肌损伤标志物ANP和BNP的mRNA和蛋白表达水平,同时炎症因子TNF-α、IL-6和IL-2的mRNA和蛋白表达水平也较LPS组有明显下调(P<0.05)。6.大鼠心肌标本进行Masson染色,发现LPS诱导后大鼠心肌纤维化明显加重,心肌细胞肥大,间隙松弛,心肌组织内空泡化明显,而给予低剂量和高剂量瑞舒伐他汀后,心肌纤维化、心肌肥大和空泡化现象明显减轻,瑞舒伐他汀能有效减轻脓毒症引起的心肌病所致心肌病理性重构。7.通过超声心动图发现,与对照组比较,LPS诱导的脓毒症心肌病存在左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension,LVEDs)和左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension,LVEDd)显著增加(P<0.05),而左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)显著下降(P<0.05);与LPS组比较,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显著缓解脓毒症引起LVEDs和LVEDd增大,以及LVEF下降(P<0.05)。8.给予LPS干预后,我们发现SD大鼠的主动脉环新生血管萌芽数较对照组显著减少,而低剂量和高剂量瑞舒伐他汀则能逆转LPS诱导的血管新生萌芽数减少(每高倍镜视野萌芽数:对照组18.82±3.64个,LPS组8.64±1.88个,LPS+低剂量瑞舒伐他汀组12.52±3.76个,LPS+高剂量瑞舒伐他汀组14.93±3.21个,P<0.05)。第二部分瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及并探讨作用机制。1.与对照组相比,LPS以剂量依赖的方式抑制细胞活性,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS(1μg/ml)时RAOEC活性显著下降,细胞抑制程度中等(P<0.01),可导致中度细胞损伤,适合下一步研究中实验浓度。2.与LPS处理组相比,RSV以剂量依赖的方式减弱LPS诱导的RAOEC损伤,RAOEC活性明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),瑞舒伐他汀4μM浓度对RAOEC活性影响最小,同时对细胞抑制程度最轻,因此后续实验瑞舒伐他汀选择4μM浓度。3.与对照组相比,单独瑞舒伐他汀(4μM)处理组RAOEC的ROS产生无显著变化,无统计学意义(P>0.05),1μg/ml LPS显著增加了RAOEC的ROS产生(P<0.01);与LPS处理组相比,4μM RSV却显著抑制了LPS诱导的ROS产生(P<0.01)。4.与对照组相比,单独瑞舒伐他汀(4μM)处理组RAOEC的MDA含量无显著变化,无统计学意义(P>0.05),1μg/ml LPS显著增加了RAOEC的MDA含量(P<0.01);与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显著降低LPS诱导的RAOEC MDA含量(P<0.01)。5.与对照组相比,LPS 1μg/ml显著抑制了RAOEC NO的生成(P<0.01);与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显著增加了LPS诱导的RAOEC NO的产生(P<0.01);与LPS+RSV组相比,Akt抑制剂Perifosine处理组NO产生量显著降低(P<0.01)。6.分子机制方面,与对照组相比,1μg/ml LPS处理RAOEC后,对Akt和eNOS的总蛋白水平无明显影响,无统计学意义(P>0.05),却显著降低了Akt和eNOS的磷酸化水平(P<0.05);与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显著增加了LPS抑制的Akt和eNOS的磷酸化水平(P<0.05)。与LPS+RSV组相比,Akt抑制剂Perifosine处理组Akt和eNOS的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。结论:1.瑞舒伐他汀能抑制LPS诱导的脓毒症大鼠心肌损伤和心功能不全,减轻炎症反应,促进大鼠的主动脉环血管新生,改善心肌重构和血管重构,降低脓毒症大鼠的死亡率。2.瑞舒伐他汀对LPS诱导的RAOEC的损伤有明显的保护作用,可显著抑制LPS诱导的氧化应激反应,降低内皮细胞ROS和MDA产生,促进NO的生成。其可能机制为:通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路促进NO生成发挥保护内皮细胞作用。