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研究目的:在出血性卒中后,由于血肿会挤压脑实质,引起颅内压升高,从而造成原发性脑损伤。当血肿内容物进入脑实质后,进一步诱发继发性脑损伤。研究发现脑出血后,机体具备内源性血肿清除能力,但血肿清除速度的快慢与患者的预后效果成正相关。因此,提高内源性血肿清除的速度是脑出血潜在的治疗策略。在脑出血后,可通过激活小胶质细胞发挥血肿清除作用。硫化氢(H2S)作为新发现的内源性气体信号分子,在中枢神经系统疾病的治疗中发挥积极作用,但硫化氢对于脑出血后血肿清除的治疗作用尚无研究。本文主要探讨脑出血后小胶质细胞硫化氢合成酶是否可以介导内源性血肿清除。研究方法:(1)采用自体血导致脑出血(bICH)和胶原酶导致脑出血(cICH)的小鼠模型,在脑出血后1-14天以western blot检测硫化氢合成酶胱硫醚β-合成酶(CBS)的蛋白表达量;在胶原酶脑出血模型中检测脑出血后脑组织中硫化氢合成能力。(2)在细胞模型中,以红细胞裂解液(RBC Lysate)处理原代小胶质细胞后,以western blot检测CBS的表达量、以吞噬实验检测小胶质细胞吞噬红细胞的能力。(3)利用可阻断硫化氢作用的ZnCl2,探究红细胞裂解液是否通过内源性硫化氢促进小胶质细胞吞噬红细胞。(4)利用cbs基因被敲除的原代小胶质细胞(Cx3cr1-cre:cbsfl/fl),检测红细胞裂解液是否通过CBS促进小胶质细胞吞噬红细胞。(5)为表明小胶质/巨噬细胞CBS在内源性血肿清除中的作用,向小胶质/巨噬细胞敲除cbs的基因工程小鼠(Cx3cr1-cre:cbsfl/fl)和对照小鼠(cbsfl/fl)的纹状体注射胶原酶,以诱导脑出血。脑出血后以神经功能损伤评分(Neurologic deficit score)、前肢放置实验(Right paw placement)和转角实验(Corner Test)检测神经行为功能损伤情况;并测量血肿体积(Hematoma Volume)和纹状体残留血红蛋白含量,以表示血肿清除能力。(6)为进一步探究CBS导致内源性清除血肿的作用是否特异性地由小胶质细胞介导,采用在小胶质细胞条件型敲除cbs的基因工程小鼠(Cxcrl-creER:cbsfl/fl),通过注射tamoxifen诱导cbs只在小胶质细胞中敲除。然后,向小鼠纹状体注射胶原酶以诱导脑出血。在脑出血后5天和14天检测血红蛋白残留量和神经功能损伤情况。(7)为进一步表明CBS通过H2S导致内源性血肿清除,Cx3crl-cre:cbsfl/fl基因工程小鼠、注射tamoxifen的Cx3crl-creER:cbsfl/fl基因工程小鼠和对照小鼠脑出血后腹腔注射缓释H2S供体ADT。在脑出血后5天和14检测纹状体血红蛋白残留量和神经功能损伤情况。实验结果:(1)小鼠脑出血后脑组织中CBS表达水平以及内源性硫化氢合成能力被上调。在胶原酶模型和自体血模型中,小鼠脑出血后3-5天CBS表达量显著上升;在胶原酶模型中,脑出血后3-5天内源性硫化氢合成能力显著上升。(2)小胶质细胞中以红细胞裂解液处理后2-12小时CBS表达量显著上升,同吋红细胞裂解液促进小胶质细胞吞噬红细胞。(3)ZnCl2可以阻断红细胞裂解液促进小胶质细胞吞噬红细胞的作用。(4)与对照小胶质细胞(cbsfl/fl)相比,在小胶质细胞中敲除cbs后可阻断红细胞裂解液促进小胶质细胞吞噬红细胞的作用。(5)与对照cbsfl/fl小鼠相比,Cx3crl-cre:cbsfl/fl鼠在脑出血后5天纹状体血红蛋白含量上升,血肿体积扩大,同时神经功能损伤加重;在脑出血后14天,Cx3crl-cre:cbsfl/fl小鼠的血肿清除能力降低,同时神经功能损伤加重。(6)与未注射tamoxifen的Cx3crl-creER:cbsfl/fl鼠本相比,Cx3crl-creER:cbsfl/fl鼠经 tamoxifen 诱导小胶质细胞敲除cbs导致脑出血后血肿清除降低,同时神经功能损伤加重。(7)脑出血后向小胶质/巨噬细胞敲除cbs的基因工程小鼠(Cx3crl-cre:cbsfl/fl)以及tamoxifen诱导的仅在小胶质细胞敲除cbs的基因工程小鼠(Cx-3crl-creER:cbsfl/fl)补充外源硫化氢缓释供体ADT,可以提高小鼠的血肿清除能力并降低神经功能损伤。结论:脑出血后小胶质细胞CBS可能通过内源性硫化氢介导内源性血肿清除。