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第一部分非洲爪蟾卵母细胞表达大鼠肌肉乙酰胆碱受体的方法学研究
目的:建立适合于研究肌肉松驰药在乙酰胆碱受体上作用的实验模型。
方法:利用电压钳方法记录非洲爪蟾卵母细胞的未去膜组、去膜未转染组和去膜转染组电压依赖性的离子通道电流,观察并分析三组电流特性。结果三组卵母细胞的静息膜电位和钳制到-60mV时的补偿电流无统计学差别,通过去除卵母细胞的卵泡膜可以去除内源性受体的干扰,在注射大鼠肌肉多聚腺嘌呤poly(A)+mRNA的卵母细胞膜上记录到典型的大鼠骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体(NicotinicacetylcholinereceptornAChR)的电流。
结论:本实验建立的模型为在细胞和蛋白水平研究肌松药的药理、毒理作用奠定方法学基础。
第二部分挥发性吸入麻醉药、链霉素对非去极化肌松药与肌肉型乙酰胆碱受体作用的影响
目的:探讨挥发性吸入麻醉药、链霉素对非去极化肌松药作用效能影响的可能机制。
方法:从大鼠肌肉提取多聚腺嘌呤poly(A)+mRNA,注入去膜的非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的离子通道,利用电压钳技术记录转染后卵母细胞电压依赖性离子通道电流。以不同浓度乙酰胆碱(ACh)刺激转染后的卵母细胞,建立Ach-离子通道电流的量效曲线。再分别观察异氟醚、七氟醚、链霉素和维库溴铵、罗库溴铵等对ACh-离子通道电流的抑制作用,计算各种药物的50%抑制率浓度(50%Inhibitionconcerntration,IC50)。然后观察相当于IC50异氟醚(七氟醚或链霉素)联合罗库溴铵(维库溴铵)使用对ACh-离子通道电流的抑制作用。
结果:异氟醚、七氟醚、罗库溴铵和维库溴铵均能快速、稳定、可逆、浓度依赖性地抑制ACh(10μM)引起的全细胞电流,其IC50分别是889μmol/L(95%CI:711~1214μmol/L)、823μmol/L(95%CI:681~997μmol/L)、33.4nmol/L(95%CI:27.1~41.7nmol/L)和9.20nmol/L(95%CI:7.90~12.3nmol/L)。联合使用异氟醚(七氟醚)和非去极化肌松药时,异氟醚、七氟醚均可显著增强非去极化肌松药抑制膜电流效应。链霉素也能浓度依赖性地抑制ACh(10μM)引起的全细胞电流,在高浓度(>5mmol/L)时链霉素完全抑制ACh诱发的电流,IC50浓度为570μmol/L,95%CI为421~914μmol/L,但增加ACh浓度不能完全克服链霉素对电流的抑制。
结论:异氟醚、七氟醚能协同增强非去极化肌松药抑制ACh诱导的已转染nAChR卵母细胞膜电流作用,其机制可能是在受体水平增加非去极化肌松药的亲和力。链霉素自身抑制膜电流能力很弱,能明显增加临床剂量范围内的非去极化肌松药抑制效应,这两类药物的作用位点是独立的,不同的,相互作用方式是单纯加和作用,其作用机理主要是链霉素通过进入离子通道内部产生阻塞作用。
第三部分发育与衰老过程中大鼠骨骼肌乙酰胆碱受体变化的研究
目的:探讨大鼠骨骼肌nAChR在发育、衰老过程中数量、亚型种类及功能的变化。
方法:逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量法检测大鼠胎鼠组(n=8)、2周组(n=18)及4周组(n=20)骨骼肌肉nAChR的ε、γ亚单位的表达量。分别从三组大鼠肌肉提取多聚腺嘌呤poly(A)+mRNA,注入去膜的非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的离子通道,采用电压钳技术比较乙酰胆碱诱发的三组卵母细胞的nAChR电流特征和维库溴铵对之的影响。同样的方法检测青年组大鼠(n=12)、中年组大鼠(n=15)、老年早期组大鼠(n=9)和老年晚期组大鼠(n=7)骨骼肌nAChRε亚单位的表达。比较组间乙酰胆碱诱发的转染后卵母细胞nAChR电流和维库溴铵与受体作用引起峰电流的变化。
结果:随大鼠鼠龄增加,大鼠肌肉nAChRγ亚单位表达量进行性下降,且在4周组没被检测出(P<0.05);ε亚单位表达量进行性升高(P<0.05)。维库溴铵抑制三组IC50浓度分别是58.1±21.3、48.9±13.2、(9.32±4.74)nmol/L。与青年组比较,老年早期组和老年晚期组大鼠骨骼肌肉n-AChRε亚单位表达量进行性下降(P<0.05)。老年早期和老年晚期组ACh激动nAChR的EC50值明显高于青年组、中年组(P<0.05)。维库溴铵对青年组、中年组和老年早期组大鼠肌肉的nAChR作用强度无差异,但对老年晚期组大鼠肌肉的nAChR作用强度明显增强(P<0.05)。
结论:骨骼肌乙酰胆碱受体在发育过程中γ亚单位逐渐由ε亚单位代替,并在4周时γ亚单位已消失。ε-nAChR对维库溴铵的敏感性要高于γ-nAChR。神经骨骼肌乙酰胆碱受体数量随年龄的增加而进行性地减少,但其对肌松药的作用强度影响较小。老化的骨骼肌乙酰胆碱受体对Ach失敏感,使维库溴铵的作用明显增强。所以在老年人麻醉中,肌松药的使用应谨慎。