论文部分内容阅读
作为鱼油主要成分的EPA和DHA等长链多不饱和脂肪酸(Long-Chain PolyUnsaturated fatty acids,LCPUFAs),是胎、婴、幼儿的视网膜与大脑皮层正常发育所必需的,对防治心脑血管等疾病起重要作用。它们的保健功能已得到人们广泛认识。通常人体合成的EPA和DHA能够满足正常的生理活动需要,但是孕妇、婴幼儿、老年人和疾病患者需要饮食中补充部分EPA和DHA。目前,LCPUFA主要来源于海洋野生鱼和单细胞微藻。由于海洋野生鱼资源日益枯竭,其产量已不能满足人们日益增长的需求,而且,由于环境污染等原因导致这类鱼油不适于孕妇和婴幼儿食用,而通过单细胞微藻发酵途径提炼鱼油成本太高。因此寻找能够持续、经济、安全的EPA和DHA生产替代来源成为亟待解决的问题。代谢基因工程技术的发展,为通过转基因技术在油料作物中生产LCPUFA提供了可能。最近,已从微藻中克隆、鉴定了一些LCPUFA合成过程中的链延长酶和去饱和酶基因,并在油料作物中成功表达,合成了EPA和DHA,但合成水平远远低于克隆这些基因的野生微藻。解决转基因植物中LCPUFA合成水平低的方法除优化基因表达、选择合理的合成代谢途径外,克隆超表达活性的基因显然是最有效的途径之一。但是,由于LCPUFA合成代谢过程中的链延长酶和去饱和酶,除保守区的少数几个氨基酸高度保守外,同源性很低,造成该类新基因克隆困难。目前,主要是通过cDNA文库杂交筛选和规模化测序相结合来筛选、克隆该类新基因,比较费时费力,成本高。近年来,公共生物信息数据库中有关各种生物的核酸、蛋白序列信息已呈爆炸式增长,为分析和鉴定某类基因提供了强大的信息资源支持。本研究拟用已知功能的LCPUFA合成代谢途径中的链延长与去饱和酶氨基酸序列在NCBI上进行PSI-BLAST搜索,一方面系统搜索整理功能已鉴定或已预测的去饱和酶和链延长酶;另一方面,对搜寻到的一些未知同源序列,通过生物信息学分析手段初步筛选、鉴定可能的去饱和酶和链延长酶。在此基础上,分别构建去饱和酶和链延长酶的进化树,绘制这些酶基因的生物详细分布表,为克隆、鉴定该类新基因提供全面系统的参考指引。生物信息学分析结果如下:1、共从NCBI数据库中搜索到功能已鉴定的267个去饱和酶和243个链延长酶,功能已预测未鉴定的107个去饱和酶和389个链延长酶,同时新分析预测了近400个去饱和酶和链延长酶类似基因。2、用neighbor-joining法构建了由532个去饱和酶构成的无根进化树,进化树共有6个骨干分枝,显示去饱和酶在进化早期就分化为6个不同亚家族。其中4个大亚家族分别为(1)First Desaturase、(2)Omega Desaturase、(3)Front-End Desaturase和(4)Sphingolipid Desaturase,与现有去饱和酶分类标准相符;另外一个是在进化起源上很古老的亚家族,仅由来源于Phytophthora infestans中的3去饱和酶构成,在进化树中位置独特;还有一个由来源于不同生物的11个去饱和酶构成的小亚家族,后两个小亚家族成员不适于现有去饱和酶分类标准分类。3、同样方法构建了由871个链延长酶构成的无根进化树,进化树共有2大支,显示链延长酶在进化早期就分化为2个不同亚家族:(1)S/MUFA链延长酶,(2) PUFA链延长酶。2个亚家族间有1个共同保守的氨基酸框,意味着所有的链延长酶可能起源相同,不同功能的分化可能是在进化过程中适应环境变化的结果。4、对去饱和酶和链延长酶进化树研究分析表明,去饱和酶和链延长酶在功能进化上至少是通过两个时期来完成的。第一个时期,这些蛋白分化成不同的亚家族,其中去饱和酶分化成6个亚家族,而链延长酶分化成2个亚家族,它们分别具有不同的底物特异性。第二个时期,每一个独特的亚家族又发生了底物专一性和未知特异性的分化,使亲缘关系很近的物种之间脂肪酸种类也出现了不同。即第一个时期限制了具有这些酶的功能范围,第二个时期则是在这些范围内发生了不同功能的分化。5、比较分析Phytophthora infestans中去饱和酶和链延长酶进化历程发现,去饱和酶在进化起源上很古老,在去饱和酶进化历程中的第一次功能分化时期就已形成,而链延长酶是在进化历程经历多次功能分化时期才形成的。表明来源于同一生物中同一代谢途径中的两种酶的进化历程可以不同。鉴于Phytophthora infestans中EPA合成途径中的去饱和酶在进化历程中的独特性,我们决定优先对预测到的来源于Phytophthora infestans中的3个去饱和酶和4个链延长酶类似基因进行克隆,并通过酵母表达系统进行功能鉴定。一方面是为了检验我们生物信息学的分析结果,另一方面是为了克隆鉴定一些超标达活性的去饱和酶和链延长酶基因,提高转基因油料作物中EPA和DHA的生产水平,结果如下:1、RT-PCR克隆到1个长度为911bp的基因片段,序列分析表明是一个新的链延长酶类似基因PinE4,在酿酒酵母中的表达产物,可将外源底物C18: 2(?9,12)脂肪酸转变成C20: 2(?11, 14)脂肪酸,表明其具有?9链延长酶活性。2、RT-PCR克隆到1个长度1013bp的基因片段,序列分析表明是一个含有2个内含子的新链延长酶类似基因PinE3,去内含子后,获得全长741bp的编码片段;同样的方法分别克隆到另外2个新的类似链延长酶基因PinE1(1022bp)和PinE2 (1044 bp)及1个新的类似去饱和酶基因PinD1 (1374bp)。本研究新预测了约400个长链不饱和脂肪酸合成过程中的去饱和酶和链延长酶类似基因,分别绘制了迄今为止包含数目最多的去饱和酶和链延长酶进化树,不但系统揭示了去饱和酶和链延长酶的进化历程,也为这些酶基因的克隆与鉴定提供了参考指引,同时Phytophthora infestans中EPA合成过程中的去饱和酶和链延长酶基因的克隆与鉴定,也为在转基因作物中生产鱼油提供了新的基因。