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鱼类脂肪沉积是当前养殖鱼类普遍发生的营养性病症,但由于鱼类的脂代谢及其调控机制,尤其是分解机制至今尚没有得到深入阐明,大大阻碍了养殖鱼类脂肪沉积人工调控技术的发展。与鱼类相比,哺乳动物脂分解代谢调控机制的研究相对完善。目前在哺乳动物上已经阐明,脂分解方式不仅仅局限于脂肪水解,脂滴自噬近年来也被认为是除脂解之外的重要降脂途径。脂滴自噬是指通过溶酶体-自噬通路参与脂滴降解的一个细胞过程,且在脂代谢及能量平衡中发挥了极为重要的作用,我们猜想,脂滴自噬或许可以作为一种降脂途径来改善鱼类的体脂沉积问题。然而,迄今为止,在鱼类中尚没有关于脂滴自噬的针对性研究。因此,基于已有的研究,本论文试图回答以下几个科学问题:(1)脂滴自噬是否存在鱼类中?(2)脂滴自噬是否参与了鱼类脂代谢调节?(3)脂滴自噬与脂肪水解之间存在怎样的关系?在本文的研究中,以斑马鱼和斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)为实验对象开展了鱼类脂滴自噬的研究。通过电镜、LC3免疫荧光与蛋白印迹等证据证明鱼类中是否存在脂滴自噬现象。通过对同位素标记脂肪酸在自噬受抑制的细胞和活体中的去向追踪、能量呼吸率和相关基因/蛋白表达的测定,并结合转录组学数据分析,验证脂滴自噬在鱼类脂代谢中的功能。药物处理细胞模型用于阐明脂滴自噬/脂肪水解引起的与脂分解代谢相关的生理生化及分子特征变化,进行对脂滴自噬与脂肪水解之间关系的初探究。本文主要的研究结果和结论如下:1脂滴自噬的存在性验证脂滴自噬作为一种新的去脂方式参与了哺乳动物脂代谢调节及能量平衡过程。然而,脂滴自噬在鱼类脂代谢中的作用还不清楚。为了探究脂滴自噬在鱼类脂代谢中的功能,本工作首先对鱼类脂滴自噬的存在进行了验证。目前对于自噬的检测主要是基于检测自噬体的直接(电镜形态观察)和间接(自噬标志蛋白)方法。微管相关蛋白1轻链3(LC3)参与了自噬体的形成,在哺乳动物中是一个可信的自噬标记物。我们发现饥饿显著性地激活了斑马鱼细胞LC3的mRNA表达水平,同时通过蛋白印迹发现饥饿诱导了LC3-II蛋白含量的增加。这些结果显示饥饿诱导了斑马鱼细胞自噬的发生。为了确定是否是脂滴自噬,我们通过扫描共聚焦显微镜观察在这一过程中脂滴是否与自噬标志蛋白LC3发生了联系。结果显示,在饥饿的状态下,脂滴和自噬标志蛋白LC3发生了共定位,这说明饥饿诱导斑马鱼细胞脂滴自噬的发生。随后,我们又通过电镜进行了进一步的验证。透射电子显微镜是验证自噬是否存在的金指标,也是最经典的方法。自噬是一个动态过程,包括自噬的起始、自噬泡的形成、膜的延伸及自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合等。在这一连续的过程中涉及了几个与膜相关的结构-多层膜结构的自噬泡、双层膜结构的自噬体和单层膜结构的自噬溶酶体。脂滴自噬属于选择性自噬的一种,指自噬体包裹的待降解内容物是脂滴。因此,通过电镜对脂滴自噬的检测标准,就是是否在自噬体/自噬溶酶体内观察到脂滴。在本工作中,我们通过透射电镜观察到了与脂滴自噬相关的超微结构-与脂滴“接触”的多层膜自噬泡以及包裹脂滴的自噬体和自噬溶酶体,再次验证了前面的结论。综上所述,饥饿可诱导斑马鱼细胞脂滴自噬的发生,证明了鱼类中存在脂滴自噬现象。2脂滴自噬在细胞脂代谢中的功能研究在前一部分工作获知脂滴自噬存在斑马鱼细胞中,本部分进行了脂滴自噬在斑马鱼细胞脂代谢功能的探究。哺乳动物研究表明,脂滴自噬是一个普遍存在的细胞过程,在正常或非正常环境下维持了细胞正常的运转。本部分工作分为三个小节,通过添加自噬抑制剂(Chloroquine/3-methyladenine;CQ/3MA)抑制斑马鱼细胞系ZFL的自噬活性,分别探讨了基础状态、饥饿状态和高脂状态下脂滴自噬在脂代谢中的功能。基础状态为细胞正常培养状态,ZFL细胞培养在LDF完全培养基或加药培养基24小时;饥饿状态下,ZFL细胞预先在含有油酸的完全培养基中培养以形成脂滴,随后进行无糖培养基饥饿处理或加药处理24小时;高脂状态为细胞营养过剩状态,ZFL细胞培养在含有250μM油酸(OA,Sigma,USA,FFA to BSA 1.5:1 molar ratio)的LDF完全培养基或加药培养基中。结果显示在基础状态和饥饿状态下,自噬功能受到抑制均导致ZFL细胞内脂滴/甘油三酯含量的增加,进而通过LC3免疫荧光和蛋白印迹分析,细胞脂滴的积聚是由于脂滴自噬的失活造成的。随后,我们检测了细胞脂肪酸的β-氧化效率和酯化效率,以解释脂滴自噬是如何调节细胞脂含量的。结果显示细胞自噬失活显著地减少了脂肪酸β-氧化和酯化效率,表明自噬功能受损导致细胞脂代谢底物-游离脂肪酸减少,从而导致脂肪酸的分解和合成活性全面下降。然而,在高脂状态下,自噬功能的抑制并没有促进细胞内脂滴的积累。同时通过对高油酸处理后细胞自噬相关基因的mRNA水平的检测,显示高油酸抑制了细胞自噬活性,这也说明脂滴自噬活性的失调可能与一些脂代谢紊乱综合症是相关的,比如脂肪肝。综上所述,脂滴自噬在鱼类细胞中是普遍存在的,通过降解脂滴产生脂肪酸底物的方式参与脂代谢的整体调控。3脂滴自噬在活体脂代谢中的功能研究在了解脂滴自噬参与了斑马鱼细胞脂代谢的调节后,我们又通过斑马鱼活体实验对脂滴自噬体外功能进行了验证。由于前一部分显示脂滴自噬在斑马鱼细胞中是普遍存在的,因此在斑马鱼体内实验中只采用了饥饿处理。斑马鱼首先投喂一周的13%的高脂饲料,目的是使斑马鱼肝脏中形成大量的脂滴但又对肝脏不产生损伤。随后,进行饥饿或暴露在100μM CQ的水溶液中24小时。结果显示:自噬活性受到抑制增加了斑马鱼肝脏脂滴/甘油三酯的含量;自噬失活降低了斑马鱼耗氧率和斑马鱼肝脏总β-氧化效率,显示斑马鱼处于一个低的代谢状态;同时通过对斑马鱼肝脏脂代谢相关基因的检测,自噬失活下调了脂代谢活性,包括脂肪酸转运、脂合成和脂分解过程。这与斑马鱼细胞上的结果是一致的,显示自噬功能受损引起脂滴分解受阻,进而导致游离脂肪酸含量的减少,造成了脂肪酸脂代谢活性的降低,影响了斑马鱼的整体代谢水平。为了研究自噬功能的失活对斑马鱼整体系统代谢造成的影响,我们又进行了斑马鱼肝脏的转录组分析。转录组数据显示,斑马鱼脂滴自噬受阻减少大部分与脂代谢(脂肪酸结合蛋白[FABP]、载脂蛋白B[ApoB]、肉碱棕榈酰基转移-2[CPT2]、短链乙酰辅酶A脱氢酶[ACADs])、乙酰辅酶A羧化酶[ACC]和乙酰辅酶A转乙酰酶[ACAT])相关基因表达的同时,也增加了糖代谢(葡糖激酶[GCK]和磷酸果糖激酶[PFK]、丙酮酸羧化酶[PC]和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[PEPCK])和蛋白分解代谢(蛋白酶体激活因子亚单位4a[PSME4a]、SUMO1激活酶亚单位1[SAE1]、和细胞因子信号传导抑制因子[SOCS])相关基因的表达。脂类、糖类和蛋白质三大能源物质共同维持了机体的能量平衡,当脂质代谢受到抑制后,机体会通过增加糖和蛋白分解代谢进行代谢补偿以维持机体的内稳态。4脂滴自噬与脂滴水解关系初探前面部分阐明了饥饿可诱导斑马鱼细胞脂滴自噬的发生,且脂滴自噬参与了斑马鱼细胞脂代谢的调节。目前已知脂滴自噬和脂肪水解均参与了斑马鱼脂分解代谢,两者之间是否存在一定的联系呢?本部分就脂滴自噬与脂肪水解之间的关系进行了初步探究。通过药物抑制来探究两者关系的实验中,选取了两种公认的抑制剂:自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤);脂解抑制剂(Atglistatin)。ZFL细胞预先在含有油酸(250μM)的培养基中培养24小时以形成脂滴,随后分别在含有抑制剂的无血清培养基下饥饿处理24小时。结果显示:脂滴自噬功能受损,下调了脂肪水解过程关键水解酶(甘油三酯脂肪酶[ATGL]和激素敏感性脂肪酶[HSL])mRNA的表达,同时降低了磷酸化的HSL(p-HSL,HSL的激活形式)和过氧化物酶增殖激活受体α(PPARα)蛋白表达;脂肪水解功能受损,也下调了脂滴自噬相关蛋白(LC3和自噬相关蛋白7[ATG7])的mRNA表达,同时通过对自噬标志蛋白的检测,降低了LC3-II的蛋白含量和增加了p62的蛋白表达(p62蛋白含量与细胞自噬活性呈负相关)。自噬失活抑制了脂解活性;脂解失活抑制了自噬活性,表明脂滴自噬与脂肪水解之间可能存在协同关系。