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异化金属还原菌(Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB)是一类能够耦合金属氧化物、电极的还原与细胞自身代谢生长的重要环境微生物,因其在金属元素地球化学循环、生态环境修复及能源回收利用等过程中发挥重要作用而备受关注。其中,希瓦氏菌属(Shewanella species)是研究较为深入的模式DMRB之一。细菌趋化响应是其一种响应外界刺激的趋向性运动。作为细菌的基本生理反应之一,其在寻找电子供受体、躲避不利生存环境等过程中扮演了重要角色。解析希瓦氏菌对包括环境污染物在内的电子受体的趋化机制,不仅可以拓宽对细菌趋化行为的认知,而且为生态修复提供了理论依据和技术支持;在希瓦氏菌中建立新的基因表达和编辑系统,可以构建更加高效的基因工程菌,拓宽其在生态修复及能源回收等领域的应用。本学位论文以希瓦氏菌为研究对象,深入解析其对电子受体的趋化机制,利用新兴的表达和编辑工具进行基因调控,拓展其在生态修复中的应用。主要研究内容和结果如下:1.Shewanella putrefaciens CN-32五价砷趋化机制的研究。首先确认了S.putrefaciens CN-32对As(Ⅴ)具有趋化响应,并阐释了 As(V)趋化的分子机理。通过多种趋化表型验证方法,发现S.putrefaciens CN-32对包括As(V)在内的多种电子受体均呈现趋化响应;通过构建突变株并验证其趋化表型,观察到S.putrefaciens CN-32对As(V)的趋化响应依赖于砷酸盐末端还原酶,而并非金属还原电子传递路径;发现As(V)趋化响应行为属于能量趋化机制,由多种而非单一甲基受体蛋白共同介导;胞内趋化信号转导路径中组氨酸激酶及鞭毛介导的运动能力在As(V)的趋化过程中发挥重要作用。该结果改变了 As(V)属于趋化抑制物的固有认知,为微生物用于砷污染的生态环境修复提供了新的思路。2.Shewanella oneidensis MR-1 中 IS(Insertion sequence)移动元件介导的成膜能力及电活性降低机制。基于S.oneidensis MR-1运动缺陷型自发突变株NMM(Non-motile mutant)的观察,在分子水平上解析了 IS移动元件介导的表型变化机制。通过对PCR扩增产物、鞭毛相关基因表达及测序结果的分析,发现ISSod2在鞭毛合成调控蛋白基因flrA编码区的插入最终导致了运动及成膜缺陷表型的形成;对比自发突变株NMM与野生株,发现两者的生长速率和菌落形态近乎一致,极容易忽略运动及成膜表型的差异而造成菌种的误用;在生物电化学系统及Cr(VI)固定体系中,NMM的电活性相较于野生株明显衰减。鉴于IS移动元件广泛分布于异化金属还原菌中,其在实际应用体系中可能诱发的负面影响不应忽视,应采取合适的培养及保存条件以减少IS移动元件引起的自发突变。该研究结果有助于避免在希瓦氏菌相关试验中易出现的菌种误用。3.S.oneidensis MR-1中IS移动元件剪切介导的运动能力恢复。基于自发突变株NMM在好养LB静置培养条件下能够发生运动能力恢复,深入分析了 IS移动元件剪切行为。通过不同培养条件下突变株表型变化情况的对比,发现氧气和希瓦氏菌趋氧性在运动表型恢复过程中扮演重要角色;区别于已知的IS剪切机制,ISSod2特异性的剪切行为并不依赖于自身编码的转座酶,也不以复制滑移的方式进行;通过对S.oneidensis MR-1及Escherichia coli K-12敲入菌株及其在静置培养条件下表型变化情况的观察,发现ISSod2特异性剪切行为在IS3家族内具有广谱性。该研究工作拓宽了对于IS移动元件影响细菌基因组可塑性的认知。4.S.oneidensis MR-1中基于鼠李糖诱导型启动子基因表达工具的构建。首先,在希瓦氏菌属中建立了一套基于大肠杆菌鼠李糖启动子(rhaBAD)的基因诱导表达系统。发现rhaBAD启动子在较宽的诱导剂浓度范围内具有很好的线性响应且泄漏表达量低;另一方面,诱导剂对希瓦氏菌无毒性且稳定性好;在实际应用中,鼠李糖诱导表达调控系统能够强化希瓦氏菌胞外电子传递能力,并提升污染物的生物转化性能。该系统扩充了希瓦氏菌属基因表达调控工具箱,将促进希瓦氏菌属的生态学应用。5.S.oneidensis MR-1中胞嘧啶单碱基编辑器的构建。建立了一套新兴的基因编辑工具——单碱基编辑器(pCEBso),实现了靶向基因的快速高效编辑。基于对单碱基编辑器的系统评估,在不产生双链DNA断裂且不提供修复模板的前提下,该套工具能够将碱基编辑框内的胞嘧啶C快速转化成胸腺嘧啶T,并成功实现双基因同时高效编辑;借助该套基因编辑工具,快速鉴定出S.oneidensis MR-1中参与N-乙酰葡萄胺和葡萄糖代谢的关键基因,并高效构建出碳源利用谱得到拓宽的基因工程菌;当以N-乙酰葡萄胺和葡萄糖作为唯一碳源时,该基因工程菌的污染物还原降解与转化能力得到显著提升。该工具同样适用于其他异化金属还原菌,将显著加速异化金属还原菌在生态修复等方面的应用。