第一部分小檗碱对Ⅱ型糖尿病脑病模型大鼠轴突病变的影响及机制研究背景:糖尿病脑病(diabetic encephalopathy)是糖尿病中枢神经系统并发症,主要临床表现为进行性认知功能障碍,主要病理学特征为脑内出现阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)样病理改变:即β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉积形成的老年斑(SP)和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFTs)。但其确切的发病机制尚未明确。近年来大量研究表明,轴突病变早于AD的两个特征性病理改变,被认为是AD的重要发病机制之一,但是轴突病变是否参与了糖尿病脑病的发病进程却不得而知,有待进一步研究。又有研究显示:小檗碱能有效缓解Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素抵抗而达到预防和治疗糖尿病作用。小檗碱可穿过血脑屏障并在海马区累积,具有缓解糖尿病中枢神经损伤的效应,但其作用机制有待进一步阐明。本研究旨在体内外模型中探讨高糖导致神经元发生轴突病变的分子机制以及小檗碱对神经元轴突损伤的保护作用。实验方法:首先,利用高糖/高脂饮食和链脲佐菌素(STZ)注射诱导建立Ⅱ型糖尿病脑病大鼠模型。随后,给予模型大鼠灌胃小檗碱治疗10周,通过Morris水迷宫实验检测空间学习记忆能力;同时,采用体内神经元示踪实验检测神经元轴突病变;免疫组织化学以及Western-blot技术检测蛋白定位与表达。其次,结合体外原代神经元培养,运用全内反射荧光显微术检测高糖和小檗碱对神经元轴突运输的影响;并进一步运用PI3K抑制剂LY294002和胰岛素信号通路激活剂insulin探讨其中可能的分子机制。结果:体内和体外实验表明,在STZ诱导的Ⅱ型糖尿病性脑病模型大鼠的海马组织中,神经元轴突出现损伤,且伴随tau蛋白的过度磷酸化,随后导致轴突运输损伤和认知功能障碍。小檗碱显著降低Ⅱ型糖尿病脑病模型大鼠外周血糖和血清胰岛素水平,从而缓解了外周胰岛素抵抗。同时,小檗碱可显著改善模型大鼠的学习记忆障碍和大脑神经元轴突病变。进一步的研究结果显示:小檗碱可显著降低模型大鼠tau蛋白磷酸化水平,且可通过上调PI3K/Akt信号通路而降低GSK3β的活性。在体外,给予高浓度葡萄糖(45 mM)处理24小时的原代神经元中,PI3K/Akt信号通路失活导致GSK3β抑制性位点Ser9的磷酸化水平显著下降,GSK3β活性显著增加,tau蛋白磷酸化水平显著增高。同时给予小檗碱进行干预后,PI3K/Akt磷酸化程度较高糖组显著增强,GSK3β抑制性位点Ser9的磷酸化水平显著增加,tau蛋白磷酸化水平较高糖组显著降低。且小檗碱干预可显著改善高糖诱导的原代神经元轴突运输障碍。进一步采用PI3K抑制剂LY294002和/或胰岛素信号通路激活剂insulin处理原代神经元,结果显示:给予LY294002处理后可有效阻断PI3K/Akt信号通路,LY294002+小檗碱处理组tau蛋白磷酸化水平较小檗碱干预组显著增高,而insulin处理组可有效逆转LY294002对小檗碱的阻断效应。结论:小檗碱可通过上调PI3K/Akt/GSK3β信号通路降低tau蛋白磷酸化水平,对神经元轴突损伤具有保护作用,从而改善Ⅱ型糖尿病脑病模型大鼠的认知功能。第二部分小檗碱对Ⅱ型糖尿病脑病模型大鼠Aβ产生的影响及机制研究背景:随着物质生活水平和疾病治疗水平的提升,糖尿病患者生存期明显延长。同时,糖尿病引起的并发症也逐渐引起人们的重视。其中,糖尿病并发症又以神经病变的发病率最高。糖尿病脑病,一种被证实的糖尿病并发症,与CNS中逐渐发展的终末器官损伤有关,且伴随认知功能障碍,严重降低糖尿病患者生活质量。有文献报道,糖尿病模型中的慢性炎症浸润导致胰岛素抵抗的发生;且外周胰岛素抵抗导致记忆、执行功能以及语言理解等方面出现损伤;同时阿尔茨海默病(AD)的标志物—寡聚肽毒性蛋白Aβ42也出现增加。此外,又有文献报道,内侧前额叶皮层(m PFC)具有协调信息监督和处理加工的能力,且大脑m PFC中的环路与各种记忆形式存在直接关联。临床研究表明,T2D中糟糕的执行功能和记忆损伤主要与m PFC、颞侧和小脑区的葡萄糖摄取/代谢密切相关。小檗碱,一种来源于天然产物中的小分子化合物,在糖尿病外周组织中已经表现出很好的抗炎和降血糖作用。但是在中枢系统中,特别是在糖尿病大鼠m PFC中的作用鲜有报到。为了更好地理解小檗碱对糖尿病患者认知功能的影响,我们采用STZ诱导的Ⅱ型糖尿病模型,研究小檗碱参与拮抗糖尿病大鼠m PFC的炎症反应以及改善胰岛素抵抗的分子机制。方法:在给予糖尿病大鼠灌胃小檗碱(200mg/Kg/d)后。采用条件恐惧试验进行认知行为评价,Western-blot检测相关蛋白表达。通过正电子发射断层扫描(PET)成像测试糖尿病大鼠m PFC中的葡萄糖摄取情况。通过商用ELISA试剂盒测定炎症介质的表达水平。组织免疫荧光和免疫组化分别检测NF-κB在mPFC中的转位和Aβ42的生成。结果:首先,我们在活体中进行PET实验,发现小檗碱促进糖尿病大鼠m PFC对葡萄糖的摄取。随后,通过Western和免疫荧光等实验,证明小檗碱可显著抑制糖尿病大鼠m PFC中炎症介质释放,缓解胰岛素抵抗以及MAPK信号通路的激活;同时,PKCη和PKCε蛋白的表达水平和NF-κB在神经元中的转位得到有效抑制。另外,神经元特异性葡萄糖转运蛋白GLUT3也被显著提高2-3倍。此外,小檗碱还降低了淀粉样前体蛋白(APP)和BACE-1的表达以及寡聚体Aβ42的产生。最后,行为学数据显示,通过小檗碱治疗,加速了糖尿病大鼠对信息的加工处理并强化了记忆功能,从而缓解了认知障碍。结论:小檗碱可以通过抑制糖尿病大鼠m PFC中炎症通路的激活和胰岛素抵抗的发生,从而改善了糖尿病大鼠认知功能的损伤。