c-Myc是一种经典的原癌蛋白,它主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、生存和粘附以及细胞大小等多种重要的细胞生物学功能。大量研究表明,c-Myc是大多数白血病融合基因的共同靶基因,在大多数患者的白血病细胞中高表达,对白血病的发生发展必不可少。c-Myc蛋白主要通过转录激活作用和转录抑制作用参与调节造血干/祖细胞的自我更新,增殖和分化。研究表明,c-Myc的转录活化作用主要通过促进细胞周期,刺激细胞生长和代谢,在组织修复重建和肿瘤的发生发展中起到关键性作用。c-Myc的转录抑制作用主要通过与Miz1结合调控下游靶基因,而对于它的的生物学意义所知甚少。研究发现,c-Myc蛋白的第394位氨基酸突变即c-Myc ^V394D（缬氨酸突变为天冬氨酸）,由于不能与Miz1结合,其转录抑制活性失活,但转录活化功能仍然正常。因此,c-Myc ^V394D这种突变型为我们特异性研究c-Myc转录抑制功能在白血病发生发展中的生物学效应提供有效的实验工具。在本课题中,我们利用逆转录病毒感染造血干/祖细胞,构建了MSCV-c-Myc-GFP和MSCV-c-Myc ^V394D-GFP过表达的细胞系,通过体内和体外一系列实验,研究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的作用。首先,我们通过尾静脉移植的方法,构建c-Myc和c-Myc ^V394D过表达的动物模型,观察它们的生存情况,分析外周血细胞变化和细胞浸润等,研究了c-Myc和c-Myc ^V394D过表达在白血病发生发展中的作用。另外,在体外培养条件下,我们通过细胞克隆形成实验,探究了c-Myc和c-Myc ^V394D过表达对造血干/祖细胞增殖能力的影响;并使用流式细胞仪分析c-Myc和c-Myc ^V394D过表达对造血干/祖细胞的周期、凋亡和分化的影响;同时利用qRT-PCR技术检测了c-Myc和c-Myc ^V394D对下游靶基因的转录调控作用,探究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的分子调控机制。体内实验结果表明,c-Myc过表达能够诱导急性粒细胞白血病的发生发展,而c-Myc ^V394D过表达不能诱导小鼠发生白血病。c-Myc过表达的小鼠在第2个月开始发病,直至第4个月全部死亡;而c-Myc ^V394D过表达和对照组的小鼠能够正常存活。同时c-Myc过表达的小鼠与对照组相比,GFP⁺细胞的比例明显增加,白细胞和血小板数量减少,粒细胞数量异常增加,肝脏和脾脏肿大,白血病细胞浸润,证明c-Myc过表达促进白血病的发生发展。体外实验结果表明,c-Myc过表达能够使造血干/祖细胞的增殖能力增强,向粒细胞分化的能力出现障碍,从而使细胞能够持续增殖;而c-Myc ^V394D不能维持造血干/祖细胞的持续增殖能力。细胞克隆形成实验发现,c-Myc和c-Myc ^V394D过表达的造血干/祖细胞克隆形成能力明显增强;从第二代克隆形成开始,c-Myc过表达的造血干/祖细胞的克隆形成能力明显高于c-Myc ^V394D过表达组和对照组,直至第四代克隆形成中对照组和c-Myc ^V394D过表达的造血干/祖细胞几乎丧失克隆形成能力。流式分析细胞凋亡发现,c-Myc和c-Myc ^V394D过表达对细胞凋亡没有明显的影响。然而,在细胞周期进程和细胞分化的研究中发现,c-Myc过表达能够诱导细胞从G1期进入S/G2期,促进细胞周期进程,使细胞维持表达c-Kit抗原,向粒细胞分化的途径障碍;c-Myc ^V394D过表达不能促进细胞周期进程,增殖和分化功能正常。另外,研究发现,c-Myc过表达抑制C/EBPα的表达,而c-Myc ^V394D过表达能够上调C/EBPα的表达,并且两者均能抑制p15和p21的表达。因此,c-Myc的转录抑制活性主要通过促进细胞周期进程,刺激造血干/祖细胞的持续增殖能力,粒细胞分化功能障碍,从而诱导急性粒细胞白血病的发生发展。