【摘 要】
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肾脏固有细胞的增殖、分化和凋亡及细胞外基质的合成和降解在肾脏的正常发育和肾脏疾病的发生发展中都有至关重要的作用。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metall
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肾脏固有细胞的增殖、分化和凋亡及细胞外基质的合成和降解在肾脏的正常发育和肾脏疾病的发生发展中都有至关重要的作用。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)是MMPs的天然抑制剂。TIMP-1是TIMPs家族的主要成份,我们前期的工作表明: TIMP-1对肾脏的影响主要包括对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响和对肾小球系膜细胞凋亡的影响,但其作用机制尚不清楚。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),是近几年出现的一种利用小的干扰RNA(small interference RNA,siRNA)高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。本研究的第一部分旨在通过RNA干扰技术探讨TIMP-1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)对TIMP-1基因的沉默效果及在TIMP-1基因沉默后,肾小球系膜细胞凋亡及ECM降解的变化,为在体内应用RNA干扰技术沉默目的基因研究奠定基础。从Gene Bank中查找大鼠TIMP-1 mRNA序列,按RNA干扰序列的设计原则进行设计、合成,并将其定向克隆于带有绿色荧光蛋白的pEGFP-1载体上,经酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-1/TIMP-1 shRNA表达载体。用脂质体法将该载体转染大鼠肾小球系膜细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后细胞可见绿色荧光,说明该载体成功地转染入细胞内。RT-PCR和Western blot结果表明转染有TIMP-1 shRNA的肾小球系膜细胞内源性TIMP-1基因和蛋白表达明显下降。按处理因素不同,将大鼠肾小球系膜细胞细胞分为正常细胞组、
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