目的:糖尿病不但能够导致各种大、微血管并发症，还能够加重甚至引起骨量减少和骨质疏松。糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP)是指糖尿病并发骨量减少，骨组织微结构改变，骨强度减低、脆性增加，易发生骨折等骨质疏松表现的一种全身性、代谢性骨病。DOP可视为糖尿病慢性并发症之一，但因其发病隐匿，既往人们对于DOP的认识不足，近年来由于糖尿病患者的逐年增加，DOP的发病率愈发增高，使糖尿病患者发生骨折风险大大增加，致残致死率高，医疗费用庞大，因此对DOP发病机制及防治靶点的深入探讨具有积极的意义。　　骨钙素(osteocalcin，OC)是仅次于骨胶原蛋白的骨第二大分泌蛋白，是唯一的只由成骨细胞产生的基质蛋白，OC与羟基磷灰石结晶结合储存于骨基质中，完成骨的矿化。OC被认为是成骨细胞分化和成熟的标志，是反映成骨细胞活性的敏感而特异的指标。高血糖能导致成骨细胞功能不全，成骨细胞分泌的OC减少，骨矿化不全，造成糖尿病患者骨质疏松和骨折风险明显增加。而近期的研究发现循环血中的OC还能够参与调节糖脂代谢，因此本课题的第一部分研究旨在探讨OC作为一种内分泌调节激素与2型糖尿病患者糖脂代谢之间的关系。　　衰老与糖尿病具有相似性，二者都属于一种慢性炎性疾病，过多的晚期糖基化终末产物、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和炎症因子的产生可引发氧化应激反应，引起骨代谢异常，导致老年性骨质疏松症和DOP的发生。因此，氧化应激是老年性骨质疏松症与DOP共同且重要的发病机制。在老年性骨质疏松症中发现沉默信息调节因子1(silent information regulator1，Sirt1)不仅能发挥抗氧化应激的作用，还能够通过调控衰老通路P53/P21及P16发挥抗衰老作用，改善骨代谢。而在DOP中尚无有关Sirt1及衰老通路作用的报道。　　Klotho是一种抗衰老基因，Klotho基因敲除小鼠表现为寿命缩短和包括骨质疏松在内的多器官早衰现象。Klotho编码的蛋白分为在特定器官内表达的膜型Klotho以及广泛分布于体液中的分泌型Klotho(secreted Klotho，sKlotho)。多项研究已经证实Klotho与骨代谢之间存在联系，有关Klotho在骨代谢中作用的研究都集中于膜型Klotho，认为膜型Klotho能作为纤维生长因子-23的辅因子调节体内钙磷代谢，从而间接影响骨代谢。而对于sKlotho在骨代谢中的作用及机制的研究尚无相关报道。在肿瘤、心血管及神经系统中均发现sKlotho具有抗氧化应激的作用，在血管内皮细胞中还发现sKlotho能抑制P53/P21通路发挥抗衰老作用。但对于sKlotho能否在高糖下骨代谢中发挥抗氧化应激及抗衰老的作用及相关机制的研究尚无报道。因此，本课题第二部分研究旨在明确sKlotho对高糖下成骨细胞的作用，并深入探讨sKlotho对高糖下成骨细胞中Sirt1及衰老通路的作用，为DOP的发病机制及防治提供新的靶点。　　研究方法:第一部分2型糖尿病患者骨钙素与糖脂代谢的相关关系　　根据1999年WHO的糖尿病诊断标准选择我院2型糖尿病(type2 diabetesmellitus，T2DM)患者(行口服葡萄糖耐量试验确诊)985例，分为男性组495例，绝经后女性组490例。均排除肝肾功能损伤;糖尿病急性并发症，恶性肿瘤，骨折史时间小于1年，闭经时间小于1年，骨质疏松，甲状腺疾病、甲状旁腺疾病及其他内分泌系统疾病，近期感染、手术、创伤等其他应激情况，孕妇，应用噻唑烷二酮类、双膦酸盐类、降钙素、糖皮质激素、雌激素、维生素D、钙剂、华法林、维生素K等影响骨代谢药物者，应用降脂药物者。　　所有受试者均过夜空腹12h，次日晨起采集静脉血于中国医科大学附属第一医院检验科及内分泌研究所测定空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹胰岛素(FINS)、空腹C肽(FCP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、钙(Ca)、磷(P)、甲状旁腺素(PTH)、25羟维生素D3(25(OH)VD3)、碱性磷酸酶(ALP)、OC、血清总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)、Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列(β-CTx)。用HOMA2软件评估胰岛β细胞功能(HOMA-β)和胰岛素抵抗(HOMA-IR)。测量受试对象的身高、体重、腰围、臀围，计算体重指数(BMI)及腰臀比(WHR)。BMI=体重(kg)/身高2(m2)，WHR=腰围(cm)/臀围(cm)。采用直线相关分析及多元逐步回归分析OC与各糖脂代谢指标之间的相关性。　　第二部分高糖下sKlotho对成骨细胞代谢的影响　　取5～9代对数生长期小鼠成骨细胞株(MC3T3-E1)，以细胞浓度为2×106个细胞接种于25cm2培养瓶中，培养细胞待其贴壁融合40％～60％后用无血清1640培养基同步化24h，分组处理:(1)正常糖组（NG，5.6mmol/L葡萄糖），(2)高渗组(HM，5.6mmol/L葡萄糖+29.4mmol/L甘露醇)，(3)高糖组(HG，35mmol/L葡萄糖)，(4)NG+Klotho组，(5)HG+Klotho组，(6)NG+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)组，(7)HG+NAC组，(8)NG+Sirt1-siRNA组，(9)HG+Klotho+Sirt1-siRNA组。　　以外源性重组Klotho蛋白干预高糖培养的MC3T3-E1，应用基因沉默技术干扰Sirt1的表达;培养24、48、72小时后采用CCK8试剂盒检测细胞增殖;培养48h后采用流式双染法(AnnexinⅤ FITC/PI)检测细胞凋亡;培养48h后采用荧光探针 DCFH-DA检测细胞内ROS;培养120h后采用ALP微板法检测ALP活性;培养120h后采用Western Blot检测成骨分化指标Runx2、OC和ALP的表达;培养72h后采用Western Blot检测通路蛋白Sirt1、P53、ace-P53、P21及P16的表达水平。　　结果:第一部分2型糖尿病患者骨钙素与糖脂代谢的相关关系　　1、男性组和绝经后女性组间的年龄、HDL-C、P1NP、OC、FBG、HbA1c、β-CTx差别有统计学意义。绝经后女性组的年龄、HDL-C、P1NP、β-CTx和OC较男性组高，而FBG与HbA1c较男性组低。　　2、直线相关分析结果显示，两组中OC均与HbA1c呈显著负相关，男性组中OC与HOMA-β呈显著正相关，但在绝经后女性组中无相关性。两组中OC与病程、FBG、FINS、FCP、HOMA-IR、HOMA-β、LDL-C、HDL-C、TG、BMI、WHR、HOMA-IR、25(OH)VD3及PTH之间均无相关性。　　3、多元逐步回归分析结果显示，两组中OC均为影响HbA1c水平的独立相关因素;男性组中OC是影响HOMA-β的独立相关因素，但在绝经后女性组中无相关性。　　第二部分高糖下sKlotho对成骨细胞代谢的影响　　1、高糖能抑制MC3T3-E1的增殖和分化功能，增加细胞凋亡率，增加细胞内ROS的产生，减少Sirt1的表达并激活衰老通路P53/P21和P16。　　行高糖浓度筛选后，发现35mmol/L葡萄糖浓度对MC3T3-E1的影响最显著。用35mmol/L葡萄糖刺激细胞后，与NG组比较，CCK8试剂盒检测细胞增殖发现高糖在刺激细胞48及72h后，细胞增殖较NG组明显下降;Westem Blot法检测分化蛋白ALP、Runx2及OC的表达提示高糖在刺激细胞120h后，ALP、Runx2及OC蛋白的表达较NG组明显降低;流式双染法检测细胞凋亡发现高糖在刺激细胞48h后，细胞凋亡率较NG组明显增加;荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS发现高糖在刺激细胞48h后，细胞内ROS的产生较NG组明显增加;Western Blot法检测通路蛋白Sirt1、P53、ace-P53、P21及P16的表达发现高糖在刺激细胞72h后，Sirt1的表达较NG组明显减少，P53、ace-P53、P21及P16蛋白的表达较NG组明显增加。　　2、sKlotho能改善高糖下MC3T3-E1的增殖和分化功能，减少细胞凋亡，并能抑制高糖下MC3T3-E1中衰老通路P53/P21和P16的激活。　　行sKlotho浓度筛选后，发现0.2ug/ml的sKlotho浓度对高糖下MC3T3-E1细胞的作用最显著。在高糖(35mmol/L)刺激下的MC3T3-E1中加入0.2ug/ml的Klotho重组蛋白干预后，与HG组比较，在sKlotho干预细胞72h后，细胞增殖较HG组明显增加;在sKlotho干预细胞120h后，分化蛋白ALP、Runx2及OC的表达较HG组明显增加;在sKlotho干预细胞48h后，细胞凋亡率较HG组明显减少;在sKlotho干预细胞72h后，衰老通路蛋白P53、ace-P53、P21及P16的表达较HG组明显减少。　　3、高糖能通过增加MC3T3-E1细胞内ROS的产生减少Sirt1的表达，sKlotho对高糖下MC3T3-E1细胞功能的改善以及对高糖下衰老通路的逆转是通过减少细胞内ROS进而增加Sirt1的表达来实现的。　　在高糖刺激下的MC3T3-E1中加入抗氧化剂NAC后，与HG组比较，细胞内ROS的产生较HG组显著减少，干预72h后，Sirt1的表达较HG组显著增加;在高糖刺激下的MC3T3-E1中加入sKlotho后，与HG组比较，细胞内ROS的产生较HG组显著减少，Sirt1的表达较HG组显著增加;以基因沉默干扰技术抑制细胞中Sirt1的表达后，再来观察sKlotho对高糖下MC3T3-E1的作用，与HG+Klotho组相比较，细胞增殖较HG+Klotho组明显减少，ALP、Runx2及OC蛋白的表达较HG+Klotho组明显减少，细胞凋亡率较HG+Klotho组明显增加，衰老通路蛋白P53、ace-P53、P21及P16的表达较HG+Klotho组明显增加。　　结论:1、在T2DM患者中，血清OC与糖代谢和β细胞功能之间存在相关性，而OC与胰岛素抵抗和脂代谢之间未发现相关关系。　　2、高糖能导致小鼠成骨细胞株MC3T3-E1功能紊乱，加剧氧化应激反应，减少Sirt1的表达并引发细胞衰老。　　3、sKlotho能有效改善高糖下体外培养的MC3T3-E1的功能，缓解氧化应激反应，并抵抗高糖引发的细胞衰老。　　4、sKlotho对高糖下MC3T3-E1功能的改善及抗衰老作用是通过减少高糖下细胞内ROS的产生进而增加Sirt1的表达来实现的。