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天然虾青素(AST)是主要存在于微藻、酵母、鲑鱼、磷虾等食品资源中的一种类胡萝卜素,因其特殊的分子结构而具有超强抗氧化活性,还具有改善氧化应激水平、抗衰老、抗炎、降血糖和血脂等功效,并且可被作为膳食补充剂以提高人体免疫力。糖尿病是一种慢性代谢类疾病,以高血糖和致命的并发症为特征,其引起的死亡人数逐年攀升,对人类健康产生巨大的威胁。近年来,通过安全有效的天然物质干预糖尿病是研究的热点。AST作为一个具有多种有益生物活性的天然资源,已被证实可以通过清除自由基以及调控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)胰岛素信号通路来改善患者体内血糖水平和胰岛素抵抗程度,但是其作用的详细分子机制尚未明确。因此,本研究以分化好的3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞为对象,采用蛋白免疫印迹(WB)、免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光(IF)等研究方法,以阐明AST作用的靶点和改善胰岛素抵抗,促进细胞进行葡萄糖摄取的分子机制。(1)天然虾青素作用靶点的确定。采用WB技术分析PI3K信号通路上相关蛋白的表达。结果显示:在胰岛敏感或胰岛素抵抗情况下,AST均能进一步诱导受胰岛素刺激的PI3K信号通路中的蛋白激酶B(AKT)在S473和T308位点的表达,上调了糖体蛋白S6激酶1(S6K1)在T389位点的磷酸化水平,但是抑制了 S6K1的底物S6和胰岛素受体底物(IRS-1)分别在S235/236和S1101位点的磷酸化。该结果表明,S6K1可能是AST作用的靶点;利用Luciferse技术体外检测AST对S6K1激酶的作用,结果显示:AST对S6K1激酶的直接抑制效果与AST的浓度呈正相关关系。S6K1是PI3K信号通路中一个重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是驱动胰岛素抵抗的关键分子要素。抑制S6K1活性可以反馈性激活PI3K信号通路。由此,可以确定AST是通过抑制S6K1反馈性调节了 PI3K信号通路。(2)天然虾青素靶向S6K1促进细胞葡萄糖吸收。利用Co-IP和WB技术阐明AST通过抑制S6K1反馈性调节PI3K信号通路的机制。结果显示:AST增加了两种细胞在胰岛素抵抗条件下胞内胰岛素受体(IR)的Y1146位点的磷酸化水平,促进了 PI3K亚基p85与IRS-1蛋白的结合。该结果表明,AST通过抑制S6K1致敏IR并由此激活PI3K信号通路。运用IF技术和酶标仪分别检测AST对葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的运转和葡萄糖吸收的影响,结果显示,AST募集更多的GLUT4蛋白至细胞膜上,增强细胞对葡萄糖类似物2-NBDG的吸收。激活PI3K信号通路中的AKT可以募集细胞浆内的GLUT4移位至细胞膜上,改善葡萄糖吸收以及促进糖原合成,并抑制糖异生。通过以上结果表明:AST通过抑制S6K1调节3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞内PI3K信号通路的转导,从而促进吸收胞外的葡萄糖,提高细胞的葡萄糖摄取能力,起到降血糖的作用。