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生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是介于病毒与细菌之间、缺乏细胞壁、呈高度多型性,可在无生命培养基中繁殖的原核细胞型微生物,可引起泌尿生殖系统感染,被归类于性传播疾病病原体之一。近年来,Mg感染率呈现上升趋势,但目前仍然没有满足临床需要的药物和疫苗可供使用。Mg最关键的外膜粘附蛋白为生殖支原体粘附素蛋白(Mg Pa),其C端具有较强的免疫原性,自发性的无细胞黏附活性的Mg突变株则缺乏Mg Pa,因此,Mg Pa在Mg的致病性方面起着至关重要的作用。本研究利用构建好的原核表达载体PET-30a(+)/Mg Pa在大肠杆菌中诱导表达Mg Pa的重组蛋白(r Mg Pa),采用噬菌体展示随机肽库技术筛选Mg Pa重组蛋白的特异性结合多肽,并对筛选到的特异性多肽进行鉴定。本研究目的:1、利用课题组前期构建好的含生殖支原体粘附素蛋白(Mg Pa)优势表位(1 075~1 364 aa)的重组载体,表达并纯化Mg Pa,为研究Mg Pa的生物学功能奠定前期实验基础。2、利用噬菌体展示随机肽库筛选并鉴定Mg Pa的特异性结合多肽,为研究Mg Pa的致病机制提供实验依据。3、构建人尿道上皮细胞(SVHUC-1)的T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖支原体的相互作用奠定基础。本研究方法:1、利用课题组前期构建好的含生殖支原体粘附素蛋白(Mg Pa)优势表位(1 075~1 364aa)重组载体(r Mg Pa)的重组菌株,用IPTG诱导表达r Mg Pa,用SDA-PAGE和Western blot进行分析与鉴定,再经Ni-NAT亲和层析纯化柱纯化重组蛋白,最后用BCA法测定其浓度。2、以r Mg Pa为靶分子,对噬菌体展示随机12肽库和7肽库进行3轮生物淘选,收集淘选后的噬菌体,对其进行扩增培养,利用碘化钠法提取并纯化噬菌体克隆的单链DNA,并进行DNA测序分析,推导出展示在噬菌体表面的外源性氨基酸序列。用ELISA、竞争性结合实验和斑点印迹实验等方法检测阳性噬菌体与r Mg Pa结合的特异性。3、用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出m RNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的Eco RⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,构建成T7噬菌体展示c DNA文库。本研究结果1、SDS-PAGE显示,Mg Pa的重组菌株在IPTG诱导下成功表达出一分子量约为37k D的目的蛋白(含6×His),利用Ni-NAT纯化柱纯化后获得了纯度较高的目的蛋白,用BCA法经核酸蛋白仪测定,其浓度达到1900μg/m L。2、利用r Mg Pa对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选,第一轮至第三轮淘选的产率依次为1.78×10-6、8.0×10-6、7.3×10-5,说明噬菌体克隆有明显富集;随机挑取了38个噬菌体克隆扩增,提取单链DNA进行测序分析,结果表明38个噬菌体展示外源肽序列中有2组一致性的核心序列,分别为:V-H-W-D-F-R-QW-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-Y/H-R-D-P-Q-T/S。噬菌体展示随机7肽库中筛选到了一条核心序列:H-Y-I-D-F-R-W。3、ELISA实验的结果显示:在从噬菌体随机12肽库中筛选到的11个代表性克隆中,有10个(P1~P10)与r Mg Pa的结合较高,为阳性噬菌体克隆;竞争性结合实验的结果表明,10个阳性噬菌体克隆与r Mg Pa重组蛋白的特异性结合能被不同稀释比例的抗r Mg Pa抗体部分抑制,且随着其稀释比例的增加其抑制效果相应的下降;斑点印迹实验检测阳性噬菌体均能与r Mg Pa发生特异性结合。4、将文库扩增后,用噬斑实验检测SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库的库容,结果为1.2×106pfu/cm3;用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。本研究结论:1、成功表达并纯化出了分子量为37k D、浓度为1 900μg/m L的重组蛋白r Mg Pa。2、成功筛选到了能与Mg Pa特异性结合的2条12肽:(V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-Y/H-R-DP-Q-T/S)和1条7肽(H-Y-I-D-F-R-W)。3、成功构建了SVHUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为研究Mg与人尿道上皮胞相互作用受体奠定实验基础。