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目前肝癌发病率和致死率居高不下,传统治疗手段并不能明显延长肝癌患者的生存期,加上肝癌较高的复发率,因此迫切需要寻找新的针对肝癌的治疗手段。肿瘤的免疫疗法通过恢复机体抗肿瘤免疫功能而达到清除肿瘤的目的,包括免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、肿瘤疫苗、过继细胞疗法等。近几年肿瘤的免疫治疗已经在多种实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性,如卡介苗或干扰素对黑色素瘤的治疗,抗程序性死亡蛋白受体1(programmed death receptor 1,PD1)/程序性死亡蛋白配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)抗体对非小细胞肺癌的治疗、白细胞介素2(interlukin 2,IL-2)对肾癌的治疗等。多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国食品及药物管理局(food and drug administration,FDA)批准临床应用,免疫治疗开启了肿瘤治疗的新方向,具有非常广阔的应用前景。目前已有多种免疫细胞用于治疗肿瘤的临床研究,包括自然杀伤细胞(natural killer cell,NK),树突状细胞(dendritic cells,DC),细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK),T细胞等。NK细胞是一类对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的淋巴细胞,其识别杀伤肿瘤的能力主要依赖于活化性、抑制性受体的交叉调控。NK细胞对靶抗原的识别不受病人HLA表型不同的限制,因而可用于治疗HLA不同的病人和杀伤携带相同抗原的不同肿瘤,同时使得制备NK细胞库成为可能。随着嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法的兴起,构建CAR修饰的NK细胞也受到了社会的关注。基于NK细胞的生物学特点,嵌合抗原受体修饰NK细胞(chimeric antigen receptor NK cells,CAR-NK)具有诸多创新和优势:细胞毒性强、对肿瘤细胞有广谱杀伤作用、经济、可规模化制备、因子风暴等副作用发生率较低、回输后不具备体内增殖能力而表现出更好的安全性。靶向血液肿瘤和实体瘤抗原的CAR-NK细胞在体外实验和动物模型中取得显著效果。原代CAR-NK细胞靶向CD19抗原对血液恶性肿瘤的细胞毒作用进入临床前研究;靶向GD2抗原杀伤乳腺癌干细胞的研究也在开展。CAR-NK-92细胞成功靶向CD138、CS1等抗原杀伤多发性骨髓瘤。然而当前CAR技术在实体瘤的研究中依然是一个巨大的挑战。除了实体瘤复杂的微环境外,缺乏特异性抗原和表达抑制性配体是主要原因。针对这些问题,我们拟采取GPC3蛋白作为肝癌细胞的特异性靶抗原,以缺乏抑制性受体的NK-92细胞为效应细胞,进而避免肝癌表达抑制配体的干扰。在方法上,我们验证了NK-92细胞对肝癌的细胞毒性,构建了靶向肝癌的CAR-GPC3载体,希望构建靶向GPC3蛋白的CAR-NK细胞,以实现对肝癌细胞增强的杀伤作用的目的,进一步提高肝癌的治疗水平。本研究包括三个章节的内容:第一章:不同来源NK细胞诱导扩增方法的建立及优化建立诱导脐带血、外周血来源的单个核细胞向NK细胞分化与扩增的方法,体外获得不同来源的NK细胞,光学倒置显微镜下观察到诱导扩增的NK细胞聚团生长、单个细胞透亮成圆形。脐带血来源的单个核细胞经过17天的诱导后,CD3-CD56+的典型NK细胞比例可达到65.9%;外周血来源的单个核细胞经过14天的诱导NK细胞比例可达到32.2%。建立和优化NK-92细胞的培养方法,99.4%的细胞具有CD3-/CD56+的表型特征。该章实验为下一步验证NK细胞对肝癌的杀伤作用提供充足的细胞来源。第二章:NK-92细胞对人肝癌细胞系的杀伤作用由于NK-92细胞为永生化细胞系,缺乏抑制性受体,成为我们建立细胞毒实验方法的首选细胞。实验结果表明其在体内外均表现出对肝癌细胞很好的杀伤作用。其中酶联免疫吸附实验(enzyme linked Immunosorbent assay,ELISA)发现NK-92细胞与5种肝癌细胞共培养时释放更多的干扰素(interferon-γ,IFN-γ),乳酸脱氢酶细胞毒实验(lactate dehydrogenase cytotoxicity assay,LDH)检测到与NK细胞共培养的肝癌细胞上清中LDH的活性增高,当效靶比为20:1时,对Huh7.5.1、Hep3B、Hep G2、SK-Hep1、SMMC7721的细胞毒性可达到20%,这些实验结果表明NK-92细胞在体外对多种肝癌细胞的杀伤作用。随后建立人肝癌细胞系Hep G2、SMMC7721的裸鼠皮下荷瘤模型。实验结果显示Hep G2细胞荷瘤裸鼠安乐死时,NK-92细胞治疗组和PBS对照组移植瘤的体积分别为180mm3、320mm3;移植瘤重量分别为0.223和0.145,移植瘤体积减小,重量减轻。SMMC7721细胞荷瘤裸鼠安乐死时,两组移植瘤的体积分别为440mm3、780mm3;移植瘤重量分别为0.3163和0.418,移植瘤体积减小,重量减轻。该实验结果验证了NK-92细胞在体内对肝癌细胞的细胞毒性。这些实验结果为下一步验证CAR-NK细胞对肝癌的杀伤作用提供了理论基础和技术平台。第三章:肝癌特异性CAR载体的构建及初步验证构建特异性杀伤肝癌细胞的CAR-NK细胞的关键是肝癌靶点的选择。荷瘤裸鼠肝癌组织的免疫组化和免疫荧光结果显示NK-92细胞治疗后GPC3+的肝癌细胞比例降低,提示GPC3蛋白有望作为肝癌治疗靶点的可能。western blot和流式实验表明多种肝癌细胞高表达GPC3蛋白。结合相关的文献报道我们最终选择GPC3蛋白作为肝癌治疗的靶抗原,并分析确定了2种CAR胞外区sc Fv区的蛋白序列。在此基础上我们成功构建三代CAR-GPC3慢病毒载体,并从RNA水平和蛋白水平验证了CAR基因在293T细胞中的表达,PCR实验以CAR基因全长为引物,DNA电泳发现只有导入CAR基因的293T细胞可见特异条带,western blot实验以CAR胞内域CD3ζ为靶蛋白,发现只有该细胞可显影出特异条带。下一步将构建CAR-NK-92细胞进行肝癌细胞系的特异性杀伤实验以验证其功能。我们首先体外制备不同来源的NK细胞,通过一系列体外实验和动物模型验证了NK-92细胞对肝癌细胞的细胞毒性,指出了NK细胞有望作为肝癌有效治疗手段的可能,为肝癌的临床治疗提供新策略。成功构建靶向肝癌细胞的CAR-GPC3慢病毒表达载体,为后期构建CAR修饰的NK细胞奠定基础。该免疫策略在肿瘤免疫治疗领域具有重要的理论意义,在个体化再生医学治疗中具有广阔的应用前景。研究者们希望CAR-NK细胞能突破当前CAR技术在实体瘤中的瓶颈,CAR技术的发展有赖于深化对NK细胞的改造和对CAR结构的深入研究,如此CAR-NK细胞才能在抗肿瘤的道路上走的更远。在下一步工作中我们将继续构建表达CAR-GPC3的NK细胞,在验证其对肝癌细胞增强的细胞毒性的基础上,制备出针对HCC的特异性免疫细胞治疗产品,该策略有望提高肝癌这一重大疾病的治疗水平。