革兰氏阴性菌(Gram negative bacteria，GNB)感染是临床常见疾病，其中发展为败血症引发内毒素中毒性休克死亡的人数近年有所增长，死亡率高达22.7％-40％。目前认为临床感染高危人群数量增加是出现上述情况的重要原因之一。鉴于(1)在临床感染高危人群中，特别是肿瘤放化疗和移植后使用免疫抑制剂的患者极易发生感染，目前尚无任何有效预防感染发生的方法和措施；(2)临床使用的抗生素和我们研制的BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白主要适用于感染性疾病的治疗，而不宜用于感染性疾病的预防。我们在构建pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒基础上，制备了AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒导入系统；并采用致死性E.coli感染小鼠模型，通过观测rAAV-signal108-BPl600-Fcγ1700重组病毒转染，对不同品系小鼠的抗感染保护作用，探讨了抗感染基因治疗在预防临床感染高危人群发生GNB感染或使感染死亡率下降的可能性。本课题研究工作主要分以下两个部分。　　 第一部分 AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒的制备。　　 1、pBV220-signal107-BPI600-Fcγ1700中间载体的构建和鉴定。　　 以HL-60细胞mRNA为模板，通过RT-nested PCR扩增获得signal108-BPI185基因片段。酶切signal108-BPI185基因片段和pBV220-BPI420-Fcγ1700重组质粒，通过连接反应获得pBV220-signal108-BPI600-Fcγ1700中间载体。将上述重组质粒转化E.coli DH5α获得阳性克隆菌，提取质粒进行酶切分析和DNA测序，结果与实验预期相符。　　 2、pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒的构建和鉴定。　　 酶切重组质粒pBV220-signal108-BPI600-Fcγ1700和pSNAV载体质粒，通过连接反应获得pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒。将上述重组质粒转化E.coli DH5α获得阳性克隆菌，提取质粒进行酶切分析和DNA测序，结果与实验预期相符。　　 3、AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700伽重组病毒的制备及其纯度和滴度的测定　　 采用脂质体转染法，将pSNAV-signal108-BPI600-Fcγ1700重组质粒导入BHK-21细胞，经抗生素G418加压筛选获得携带signal108-BPI600-Fcγ1700目的嵌合基因的载体细胞株。用重组HSV1-rc/△UL2辅助病毒感染上述载体细胞株，获得AAV2-signal108-BPI600-Fcγ1700重组病毒(简称rAAV-BF)。利用rAAV抵抗氯仿的特性，采用氯仿处理-PEG/NACL沉淀一氯仿抽提法对rAAV-BF进行纯化，SDS-PAGE测定rAAV-BF纯度大于95％。以地高辛标记的CMV启动子序列为探针，采用点杂交方法测定rAAV-BF滴度为2×1012v.g./ml。　　 第二部分 rAAV-BF转染对不同品系小鼠抗感染保护作用的比较研究。　　 1、rAAV-BF对CHO细胞的转染和目的重组蛋白的检测。　　 dot-blot检测证实目的重组蛋白在CHO细胞中得到表达，其含量与病毒转染数量呈剂量依赖关系；Western-blot检测显示目的重组蛋白还原后，在泳道上出现一条相对分子量为48KD的条带；在未还原情况下，泳道上出现一条相对分子量为96KD的条带，与实验设计预期结果相符。　　 2、rAAV-BF对小鼠肌肉组织的转染和目的基因在转录和蛋白表达水平的检测。　　 RT-PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳上出现一条300bp的DNA条带，与预期产物大小相符；免疫组化方法检测显示rAAV-BF转染组小鼠肌肉组织切片肌纤维呈棕黄色，表明目的重组蛋白在rAAV-BF转染组小鼠注射部位骨骼肌细胞中得到表达。　　 3、小鼠血清中目的基因产物及其主要生物学作用的检测。　　 改良酶联免疫吸附实验证实两品系小鼠血清中均存在目的基因产物；血清中目的基因产物具有中和内毒素和杀伤E.coli的作用。　　 4、rAAV-BF转染小鼠对最小致死量E.coli感染攻击的保护作用。　　 两品系小鼠E.coli O111：B4感染最小致死量(MLD)分别为2.5×104cfu/只和4×105cfu/只。MLD E.coli腹腔感染后，两品系小鼠rAAV-BF转染组的存活率(35％，36.6％)显著高于PBS对照组小鼠(5％，0％)，表明目的嵌合基因转染，可显著增强两品系小鼠对MLD E.coli感染攻击的抵抗作用。　　 5、rhAV-BF转染与抗生素联合应用对小鼠协同保护作用的检测。　　 MLD E.coli O111：B4腹腔感染后，两品系小鼠rAAV-BF转染与头孢呋辛钠联合应用组存活率(65％-85％)显著高于头孢呋辛钠组(5％-10％)和rAAV-BF转染组(35％-40％)；C57BL/6小鼠联合应用组存活率(85％)显著高于Balb/c小鼠(65％)，证实rAAV-BF转染与抗生素联合应用具有协同抗菌作用。　　 6、MLD E.coli感染小鼠血清中内毒素含量及主要脏器病理变化的检测。　　 MLD E.coli O111：B4腹腔感染两品系小鼠后，rAAV-BF转染组血清中内毒素含量显著低于PBS对照组小鼠；垂死对照组小鼠主要脏器血管扩张淤血明显，与内毒素休克引发的病理学改变相符；rAAV-BF转染组小鼠主要脏器的病理学变化明显减轻。　　 本研究首次采用抗感染基因治疗在致死性E.coli感染小鼠模型中获得成功，表明抗感染基因治疗具有潜在应用价值，对预防临床感染高危人群发生GNB感染和降低感染死亡率具有重要意义。