论文部分内容阅读
角毛壳菌(Chaetomium cupreum Ames)是一种优良的生物防治真菌,能有效防治多种植物病原菌引起的病害;几丁质酶是其生防过程中产生并发挥重要作用的细胞壁水解酶类。以角毛壳菌(C. cupreum)几丁质酶为研究对象,构建高效表达几丁质酶的基因工程菌株;并通过密码子改造、多拷贝整合转化子的筛选、发酵条件优化等方法提高了几丁质酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中的表达量。为几丁质酶工业化生产提供优良的基因工程菌株,为研究和开发新型生物农药奠定坚实的基础。在模拟自然环境条件下,分别以3种植物病原真菌细胞壁诱导角毛壳菌(C. cupreum)细胞壁水解酶类的产生;半定量RT-PCR分析表明,几丁质酶Chi58基因被诱导表达,推测几丁质酶Chi58基因可能是角毛壳菌(C. cupreum)几丁质酶系的一个重要组分并参与角毛壳菌(C. cupreum)的生物防治作用。因此,本文通过反向PCR方法克隆了几丁质酶基因Chi58全长序列,为角毛壳菌(C. cupreum)的生物防治机理的研究奠定基础。Chi58基因已成功注册到GenBank数据库(登录号为:DQ886936),经生物信息学分析表明,CHI58包含1个N端信号肽序列、1个几丁质结合区(ChBD)、富含半胱氨酸的连接区及糖基水解酶18家族催化区结构域。ChBD与植物几丁质酶中ChBD的位置及氨基酸组成相似,同属于ClassI几丁质结合域类型。构建载体pYES2-Chi58和pPIC9K-Chi58分别转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158及毕赤酵母(P. pastoris)GS115。经酶活性测定表明,在酿酒酵母(S. cerevisiae)表达系统中,几丁质酶活性在诱导后第60h达到最高值,酶活为0.33U;而在毕赤酵母(P. pastoris)中酶活最高值为39U,出现在诱导后第120h,酶活性较酿酒酵母(S. cerevisiae)提高约120倍。SDS-PAGE及Zymogram验证了几丁质酶CHI58被分泌到毕赤酵母(P. pastoris)细胞外大量表达,且具有几丁质酶活性。发酵液中几丁质酶酶促反应最适温度为45℃;最适pH值为5.8;在70℃下具有较好的热稳定性;转化子经10代传代培养后仍具有较高的几丁质酶活性。几丁质酶对可溶性底物(乙二醇几丁质)及不溶性底物(胶态几丁质、粉末几丁质、羧甲基壳聚糖)降解作用不同,不能降解可溶性的乙二醇壳聚糖。金属离子及化合物可以影响几丁质酶的活性,其中Ba2+和NH4+对几丁质酶活性的影响最大,使酶活性分别提高了171.2%和80%;而Mg2+和K+使酶活性分别提高了21.2%和24.4%;其它金属离子及化合物对几丁质酶均具有抑制作用,其中Ca2+、Mn2+和NaN3对酶活的抑制作用最弱。分析影响CHI58在毕赤酵母(P. pastoris)中表达量的内、外因素表明,密码子改造是提高外源基因表达量的最直接有效地方法。将Chi58基因中相距较近的5个编码精氨酸的密码子CGC突变为毕赤酵母(P. pastoris)使用频率较高的AGA后,Chi58在毕赤酵母(P. pastoris)中的表达量提高了约3倍。经密码子改造、多拷贝整合筛选、发酵条件优化后,CHI58的酶活值最高达246.68U,为初始几丁质酶活性的6倍。通过SOE-PCR方法获得了几丁质结合域(ChBD)缺失突变体,将缺失突变体在毕赤酵母(P. pastoris)中进行表达,结果表明,ChBD的存在对不溶性几丁质的绑定和吸附具有重要的作用。将缺失突变体的转化子发酵液浓缩10倍进行体外抑菌试验,发酵液对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、杨树叶枯病菌(Septoria tritici)及稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有不同程度的抑制作用,但抑制率较低,最高抑菌率仅为15%;而Chi58的转化子发酵液浓缩10倍后,最高抑菌率可达40%。由此说明,缺失几丁质结合域的几丁质酶对植物病原菌的抑制作用明显降低,几丁质结合域的存在对几丁质酶的生物防治作用具有重要意义。