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目的:随着现代医学的不断进步与发展,临床癌症治疗从传统的手术治疗和放化疗,发展到现今的生物治疗。后者包括生物大分子靶向药物治疗与免疫细胞治疗,如工程化T细胞受体T细胞（T cell receptor engineered-T cell,TCR-T）治疗和工程化嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor engineered T-cell,CAR-T）治疗等免疫细胞治疗。免疫细胞治疗因其瞩目的临床试验疗效被认为是最有希望攻克癌症的治疗方式。这些细胞治疗都是体外对T细胞进行基因改造,以提高T细胞的抗原识别和杀伤能力。回输的T细胞数量、活力及亚群比例对于细胞治疗疗效密切相关。因此,探索T细胞体外分离、激活与扩增的方式是细胞免疫治疗的关键。环黄芪醇（cycloastragenol,CAG）是中药黄芪的主要皂苷成分,被认为具有免疫调节、抗炎、抗氧化的作用,是中药提取化合物中现今唯一发现的端粒酶激活剂。本实验利用不同浓度的CAG联合细胞因子诱导培养脐带血来源T细胞,利用多色流式细胞技术检测T细胞的增殖倍数和细胞表型的变化,以观察不同浓度的CAG对脐带血来源的T细胞扩增的影响,为以T细胞为基础的细胞免疫疗法提供新的培养方案,奠定实验基础。研究方法:1.理论研究:通过文献查阅和梳理,探讨T细胞免疫学特性及T细胞在免疫细胞治疗中的研究进展,从环黄芪醇的现代药理研究为基础,探究环黄芪醇在体外对T细胞扩增和细胞表型的影响。2.实验研究:2.1 T细胞体外培养条件摸索:以CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞比例分别为1:2、1:1、2:1、3:1的磁珠分别活化来源于外周血或脐带血的T细胞,利用含5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的RPMI 1640完全培养基连续培养T细胞7天。利用多色流式技术检测T细胞扩增和细胞表型变化情况,统计分析得出最佳的外周血和脐带血来源的T细胞活化条件。以CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞比例为1:1的磁珠分别活化来来源于外周血或脐带血的T细胞,分别置于IL-2（50 IU/ml）、IL-7（5 ng/ml）、IL-15（5 ng/ml）、IL-7（5 ng/ml）和IL-15（5 ng/ml）联用组的RPMI 1640完全培养基连续培养7天。利用多色流式技术检测T细胞扩增和细胞表型变化情况,统计分析得出最佳的外周血和脐带血来源的T细胞培养细胞因子条件。以相同冻存体积1ml,不同T细胞冻存密度（1E7/ml、2E6/ml、5E5/ml）分别冻存外周血和脐带血来源的T细胞,统计分析得出T细胞的最佳冻存密度。以相同冻存密度2E6/ml,不同T细胞冻存体积（1ml、0.5ml、0.2ml）分别冻存外周血和脐带血来源的T细胞,统计分析得出T细胞的最佳冻存体积。2.2不同浓度CAG联合细胞因子体外扩增脐带血来源T细胞:脐带血来源T细胞在CD3/CD28抗体偶联磁珠与CD3+T细胞比例为3:1、RPMI 1640完全培养基（含5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15）的培养条件下,以0、0.04、0.2、1、5μM不同浓度CAG联合IL-7和IL-15为实验组,和DMSO对照组连续培养T细胞11天,利用多色流式技术检测T细胞扩增和细胞表型变化情况,用GraphPad Prism 6.0进行数据统计分析。结果:2.1 T细胞体外培养条件摸索结果:来源不同的T细胞最佳的活化条件不同,外周血来源的T细胞经磁珠比1:2的磁珠活化后,连续培养7天的T细胞累积增殖倍数最高,提示外周血来源T细胞的最佳磁珠/细胞活化比例为1:2;脐带血来源的T细胞经磁珠比3:1的磁珠活化后,连续培养7天的T细胞累积增殖倍数最高,提示脐带血来源T细胞的最佳磁珠/细胞活化比例为3:1。不同细胞因子培养T细胞的实验中,外周血和脐带血来源的T细胞利用细胞因子IL-7和IL-15联用连续培养T细胞7天,不仅可以促进T细胞增殖,又可以保持较高的TSCM细胞亚群,优于其他细胞因子的培养条件。T细胞冻存条件实验:外周血来源的T细胞的最佳冻存密度为1E7/ml,最佳细胞冻存体积为1ml。脐带血来源的T细胞的最佳冻存密度为1E7/ml,最佳细胞冻存体积为0.5ml。2.2不同浓度CAG联合细胞因子体外扩增脐带血来源T细胞结果:利用磁珠比例3:1活化脐带血来源的T细胞后,浓度为0.2、1μM的CAG与细胞因子IL-7和IL-15联用组促T细胞扩增作用显著高于单独使用细胞因子IL-7和IL-15联用组,且可以促进CD8+T中TSCM的CD197+CD45RA+细胞表型的表达,即维持CD8+T中高比例的TSCM亚群。5μM CAG组与DMSO对照组相比差异不显著,提示高浓度CAG并无促T细胞增殖作用。结论:低浓度CAG联合IL-7和IL-15可以显著提高IL-7和IL-15联合培养的T细胞扩增活性,并能保持CD8+T细胞中高比例的TSCM亚群。