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高血压病是一种常见病、多发病，极易导致心、脑、肾等靶器官损害，严重威胁人类的健康。其中，由心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast，CFs)增殖和胶原表达过多所导致的心肌纤维化是高血压心室肥厚由代偿向失代偿转化的重要病理过程，是引发心力衰竭的核心环节。目前心肌纤维化的确切发病机制并不十分明确，但近年来心肌纤维化的治疗已成为国内外研究的热点。其中，过氧化物酶体增殖剂激活型受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)与心肌纤维化的关系越来越受到人们的关注。PPARα和PPARγ激活可以抑制心肌纤维化，但与它们结构和功能相类似的PPARβ/δ对心肌纤维化的作用却未见报道。
本研究旨在细胞水平模拟心肌纤维化，探索PPARβ/δ激活对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)诱导的成年大鼠CFs胶原表达和细胞增殖的影响及其可能的机制，为心肌纤维化的治疗提供新的作用靶点，以有利于抗心肌纤维化药物的研发。
第1章成年大鼠心肌成纤维细胞PPARβ/δ的表达情况。
目的：
PPARβ/δ体内分布广泛，其中心脏PPARβ/δ表达水平较高。心脏主要由心肌细胞和CFs组成。心肌细胞表达PPARβ/δ，但CFs是否表达PPARβ/δ至今尚未见报道。本研究体外成功地培养了成年大鼠CFs，并在此基础之上探讨成年大鼠CFs是否表达PPARβ/δ。
方法：
1.采用胶原酶—胰酶—胶原酶消化和差速贴壁法分离成年大鼠CFs。倒置显微镜和免疫细胞化学染色鉴定细胞，同时绘制细胞生长曲线了解生长特性。
2.以乳鼠心肌细胞作为阳性对照，采用RT-PCR和Westem blot研究成年大鼠CFs是否表达PPARβ/δ。
3.从mRNA水平研究CFs中PPARs 3个亚型的表达情况。
结果：
1.采用胶原酶—胰酶—胶原酶法分离细胞，细胞收率高，而且培养成本较低。倒置显微镜下，原代培养的CFs呈梭形或不规则三角形，胞质淡折光性强，细胞核较大，呈椭圆形，无自发性搏动。培养的细胞波形蛋白染色阳性，Ⅷ因子染色阴性，α-actin染色阴性，符合CFs染色特征，细胞纯度大于98﹪。第3-5代CFs的生长曲线无明显差异，适于开展细胞实验。
2.成年大鼠CFs在mRNA和蛋白两个水平都检测到PPARβ/δ表达，而且CFs的PPARβ/δ表达量较心肌细胞低(P<0.01)。
3.CFs同时表达PPARs 3个亚型，PPARβ/δ和。PPARα表达量较高，而PPAR7表达量最低(P<0.01)。
结论：
我们建立的成年大鼠CFs培养方法成本较低，细胞收率较高，细胞纯度高，第3-5代细胞适于开展相关实验。成年大鼠CFs表达PPARβ/δ，而且在。PPARs 3个亚型中表达量较高。CFs表达PPARβ/δ是开展后续实验的前提和基础。
第2章GW501516对心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响。
目的：
PPARa和PPARγ激活可以抑制心肌纤维化，但与它们结构和功能相类似的PPARβ/δ对心肌纤维化的效应却未见报道。本研究成功地建立了Ang Ⅱ诱导的成年大鼠CFs胶原表达和细胞增殖的模型，并在此基础之上探讨PPARβ/δ激动剂GW501516对细胞胶原表达和细胞增殖的影响。
方法：
1.摸索AngⅡ刺激成年大鼠CFs胶原表达和细胞增殖的量效和时效关系，建立AngⅡ诱导的CFs胶原表达和细胞增殖模型。
2.利用MTT法探索成年大鼠CFs使用GW501516的安全剂量范围。
3.采用Western blot、<'3>H-proline掺入和<'3>H-TdR掺入等方法，探讨GW501516对Ang Ⅱ诱导的成年大鼠CFs胶原表达、胶原合成和细胞增殖的影响。
结果：
1.(1-1000)nM Ang Ⅱ作用于CFs(6-36)h，可以浓度依赖和时间依赖地促进CFs表达Ⅰ型胶原。(0.1-1000)nMAngⅡ作用于CFs(12-48)h，可以浓度依赖和时间依赖地增加CFs对<'3>H-TdR的摄取量。
2.(1nM-1μM)GW501516对CFs的细胞数无影响(P>0.05 vs.对照组)，而10μM的GW501516明显地降低CFs的细胞数(P<0.01 VS.对照组)。
3.(1nM-1μM)GW501516预处理CFs 1h，可以浓度依赖性地抑制Ang Ⅱ诱导的CFs胶原表达和胶原合成，而GW501516本身对细胞的胶原表达和胶原合成无影响。(1nM-1μM)GW501516浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导的CFs<'3>H-TdR的摄取，而GW501516不影响细胞对<'3>H-TdR的基础摄取量。
结论：
成功建立AngⅡ诱导的CFs胶原表达和细胞增殖的细胞模型。eeARβ/δ激动剂GW501516可以抑制Ang Ⅱ诱导的细胞胶原表达和细胞增殖，其中抑制细胞胶原表达的效应与其降低细胞胶原的合成有关。
第3章PPARβ/δ激活介导GW501516对心肌成纤维细胞的效应。
目的：
GW501516可以抑制AngⅡ诱导的细胞胶原表达和细胞增殖。GW501516的效应除可能通过激活PPARβ/δ来实现外，也可能通过调节PPARβ/δ的表达量或通过不依赖于PPARβ/δ的途径来实现。本研究观察了GW501516对CFs PPARβ/δ表达量的影响，并利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)来探索GW501516的作用是否依赖于PPARβ/δ。
方法：
1.采用RT-PCR和Western blot探讨GW501516是否影响CFs PPARβ/δ的表达量。
2.以Stealth RNAi Negative Control作为阴性对照，3对针对PPARβ/δ的Stealth siRNA(RSS340860、RSS340861和RSS340862)转染CFs。转染细胞48h后，RT-PCR和Western blot检测各组细胞PPARβ/δ的表达水平，筛选有效干扰序列。
3.有效干扰序列抑制细胞PPARβ/δ表达后，采用Western blot、<'3>H-proline和<'3>H-TdR掺入等方法研究GW501516对Ang Ⅱ诱导的细胞胶原表达、胶原合成和细胞增殖的效应有无变化。
结果：
1.GW501516、Ang Ⅱ和GW501516+Ang Ⅱ组细胞PPARβ/δ的表达量与对照组相比无差异(P>0.05)。
2.Negative Control不影响CFs PPAR~的表达(P>0.05 vs.对照组)。而3对Stealth siRNA都显著地抑制细胞PPARβ/δ的mRNA和蛋白表达(p<0.01 vs.对照组)，其中RSS340860的抑制作用最强，分别降低PPARβ/δmRNA和蛋白表达83﹪和80﹪。
3.RSS340860抑制CFs PPARβ/δ表达后，逆转了GW501516对Ang Ⅱ诱导的细胞胶原表达、胶原合成和细胞增殖的抑制作用(p<0.01 vs.GW501516+AngⅡ组)。而Negative Control对GW501516的效应无影响(p>0.05 vs.GW501516+AngⅡ组)。
结论：
GW501516不影响CFs PPARβ/δ的受体表达量；RSS340860能显著地抑制CFs PPARβ/δ的表达；GW501516对CFs的效应具有PPARβ/δ依赖性。因此，PPARβ/δ激活介导了GW501516对CFs的效应。
第4章初步探讨PPARβ/δ激活所产生效应的机制。
目的：
本实验旨在研究PPARβ/δ激活所产生效应的可能机制。以往的研究表明，Ang Ⅱ诱导的CFs胶原表达和细胞增殖可能与其刺激细胞生成活性氧(reactiveoxygen species，ROS)有关。而PPARγ激动药通过调节细胞ROS的生成，可以抑制细胞胶原表达和细胞增殖。PPARβ/δ的效应也可能与其调节细胞ROS的生成有关。
方法：
1．荧光显微镜和流式细胞仪测定GW501516是否影响Ang Ⅱ诱导的CFsROS生成。
2．采用Western blot、<'3>H-proline掺入和<'3>H-TdR掺入等方法，探讨ROS是否参与GW501516对CFs胶原表达、胶原合成和细胞增殖的抑制作用。
结果：
1．与对照组相比，AngⅡ组CFs ROS的生成显著增加(p<0．01)，GW501516组细胞ROS的生成无明显变化(p>0．05)。而GW501516预处理CFs后显著地抑制AngⅡ诱导的CFs ROS生成(P<0．01 vs．AngⅡ组)。
2．Ang Ⅱ促进CFs胶原表达、胶原合成和细胞增殖，而ROS生成抑制剂DPI和GW501516可以同等程度地抑制AngⅡ诱导的细胞胶原表达、胶原合成和细胞增殖。
结论：
GW501516抑制Ang Ⅱ诱导的CFs胶原表达和细胞增殖的作用与其抑制细胞ROS的生成有关。ROS参与了PPARβ/δ激活所产生的效应。