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目的:研究委陵菜积雪草酸(asiatic acid from potentilla chinensis,AAPC)对非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝细胞脂质沉积、氧化应激、炎症反应、脂肪生成相关蛋白以及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)相关信号通路基因及蛋白的表达情况,探讨AAPC对NAFLD大鼠肝细胞脂代谢的影响及其调控作用机制。方法:1.NAFLD大鼠模型的制备80只雄性SD大鼠分为2组:Ⅰ组(28只)和Ⅱ组(52只),Ⅰ组大鼠给予基础饲料喂养,Ⅱ组大鼠则采用高脂饲料喂养制备NAFLD模型,共8周。第8周末随机挑选Ⅰ组和Ⅱ组大鼠进行肝脏病理检查,确定造模成功后,将Ⅰ组大鼠随机分为2组,即正常对照组和委陵菜积雪草酸对照组(AAPC对照组);Ⅱ组则设为模型组;水飞蓟宾阳性对照组(Silibinin组);委陵菜积雪草酸低、高剂量组(AAPC低、高剂量组)。在实验期间,除了每天继续给予高脂饲料喂养外,阳性对照组灌胃给予Silibinin 26.25 mg/kg/d,AAPC低、高剂量组分别灌胃给予AAPC 4、8 mg/kg/d,AAPC对照组灌胃给予AAPC 8 mg/kg/d,正常对照组及模型组则灌胃给予等量生理盐水。给药干预10周后,各组大鼠腹主动脉取血,并取出肝组织备用。2.AAPC对NAFLD大鼠肝脂质沉积的影响全自动生化分析仪检测AAPC对大鼠血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)水平的影响,试剂盒检测试AAPC对大鼠血清FFA含量的影响。此外,油红O染色检测AAPC对大鼠肝细胞脂滴形成的影响。3.AAPC对NAFLD大鼠脂质生成相关蛋白的影响Western blot 法检测肝组织 SREBP-1c、LXRα、FAS、ACC1、AMPK和p-AMPK蛋白的表达。4.AAPC对NAFLD大鼠肝损伤的影响全自动生化分析仪检测AAPC对大鼠血清谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、白蛋白(Albumin,ALB)和球蛋白(Globulin,GLB)水平的影响;H&E和Masson染色检测大鼠肝细胞结构病变及胶原形成情况。5.AAPC对NAFLD大鼠氧化应激及脂质过氧化的影响试剂盒检测血清和肝组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Maleic diadehyde,MDA)的含量,此外,还检测了肝组织GSH-Rd、GSH-Px和MPO的含量。6.AAPC对NAFLD大鼠炎症反应的影响ELISA试剂盒检测肝组织IL-6和TNF-α的含量,同时,Western blot法检测肝组织内IL-6和TNF-α蛋白的表达。此外,Western blot法检测肝组织 NF-κκB p65、p-NF-κκB p65、IκB-α 和 p-IκB-α 蛋白的表达。7.AAPC对NAFLD大鼠内质网应激信号通路基因和蛋白的影响免疫组化法测定大鼠GRP78、PERK、eIF2α和CHOP的表达;RT-PCR法检测肝组织 GRP78、PERK、eIF2α、CHOP 和 ATF6 mRNA 的表达;Western blot 法检测肝组织 GRP78、PERK、p-PERK、eIF2αα p-eIF2α、ATF4、CHOP、IRE1、p-IREl、XBP-1、JNK、p-JNK、ATF6、Caspace12 蛋白的表达。结果:1.AAPC减轻NAFLD大鼠肝脏脂质沉积本研究采用高脂饲料喂养SD大鼠,共8周,制备NAFLD模型。结果显示,模型组大鼠肝脏指数明显升高;模型组大鼠血清TC、TG、LDL、FFA、AST和ALT水平均显著升高,HDL水平显著降低;H&E染色、Masson染色和油红O染色结果表明,模型组肝细胞脂肪变性严重,且肝细胞排列紊乱,肝细胞呈明显空泡、气球样变,肝细胞内出现明显胶原沉积及大量红色脂滴积累。以上结果说明该模型符合NAFLD的病理改变特征,提示造模成功。给予AAPC治疗后,实验结果表明,AAPC(4、8 mg/kg)能显著降低血清中TC、TG、LDL和FFA的水平(p<0.01),同时能显著升高血清中HDL的水平(P<0.01)。此外,油红O染色结果显示,模型组中脂滴的形成显著高于正常组,AAPC干预后,肝细胞内脂滴形成明显减少。以上结果提示,AAPC能明显减少脂质沉积,对NAFLD具有显著改善作用。2.AAPC调控大鼠肝脏脂肪生成相关蛋白的表达Western blot实验结果显示,与正常组相比,HFD诱导的大鼠肝组织中AMPK和p-AMPK蛋白表达水平显著下调,而SREBP-1c、ACC1、FAS和LXRα表达显著上调。给予AAPC干预后,显著逆转了 NAFLD大鼠中的脂质生成蛋白的异常表达(p<0.01)。这些结果表明,AAPC可能通过改善脂肪生成相关蛋白水平,从而改善血脂异常。3.AAPC改善NAFLD大鼠肝损伤实验发现,AAPC干预后,能显著降低HFD诱导的NAFLD大鼠升高的肝指数(p<0.05)。全自动生化仪检测结果表明,AAPC还能显著降低血清中AST和ALT的水平(p<0.01)。此外,H&E和Masson染色结果显示,AAPC可以明显减轻肝组织细胞损伤,同时减少胶原沉积。结果提示,AAPC能降低大鼠血清内酶的含量,从而减轻肝细胞损伤程度。4.AAPC减轻NAFLD大鼠氧化应激及脂质过氧化与正常对照组相比,模型组血清和肝组织的SOD水平显著降低,而MDA的水平则显著升高,给予AAPC干预后,SOD水平显著升高,MDA的水平显著降低(p<0.05或pp<0.01)。此外,AAPC能显著降低肝组织MPO的含量,并显著升高GSH-Rd和GSH-Px的水平(p<0.05或p<0.01)。以上结果提示,AAPC能显著减轻HFD诱导的大鼠肝组织氧化损伤。5.AAPC抑制NAFLD大鼠肝脏炎症反应ELISA试剂盒检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝组织中IL-6和TNF-α含量均显著升高,给予AAPC处理后,IL-6和TNF-α的含量均显著降低(pp<0.05或pp<0.01)。相似的,Western blot实验结果也显示,AAPC能显著降低IL-6和TNF-α的蛋白表达水平(p<0.01)。此外,Western blot实验结果还显示,给予药物AAPC干预后,能显著降低肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKB-α 和 p-κB-α 蛋白的表达(p<0.01)。以上结果提示,AAPC可能通过抑制NF-κB信号通路,减少炎症因子释放,从而减轻炎症反应。6.AAPC抑制NAFLD大鼠肝脏内质网应激信号通路基因和蛋白的表达RT-PCR和Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝组织中GRP78的蛋白表达水平显著升高,经药物AAPC干预后,GRP78蛋白的表达显著降低(p<0.01)。进一步研究发现,给予HFD喂养后,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4和CHOP的基因和蛋白表达水平显著增加,给予AAPC干预后,这些基因和蛋白的异常表达得到了显著的逆转(pp<0.01)。此外,实验结果还显示,AAPC可以显著抑制IRE1、p-IRE1、XBP-1、JNK、p-JNK、ATF6和Caspase12的蛋白表达水平。以上实验结果提示,AAPC可能通过抑制ERS信号通路蛋白的表达,减轻ERS反应。结论:AAPC能减轻HFD引起的大鼠肝脏脂肪变性和肝细胞损伤,其可能的机制是:AAPC能够减轻氧化应激、增强抗氧化防御系统、抑制NF-κB通路相关蛋白的表达,从而降低炎症因子释放;此外,AAPC还通过抑制ERS相关通路蛋白的表达,减轻ERS反应从而减轻肝细胞凋亡和脂质代谢紊乱。