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神经红蛋白(Neuroglobin，NGB)是近期由德国科学家Burmester等在人和鼠中发现的一种新颖珠蛋白的类型，它主要在脑、视网膜等神经组织中表达，在缺氧的条件下(例如人患了中风病)能够保护神经细胞免受伤害，并具有许多与人类生命过程息息相关的潜在生理功能。通过研究NGB的结构、性质与功能，可以为阐明缺氧/缺血引起的神经系统疾病的分子机制提供证据，并为神经系统疾病治疗的药物设计提供信息、思路和理论依据。为此，本论文研究了神经红蛋白(NGB)的基因表达、分离纯化和谱学表征，并对其化学基础及潜在的生物功能进行了探讨。主要工作有：
一、神经红蛋白的基因表达、分离纯化和谱学表征。将载有NGB基因的pET3a质粒转入E.ColiBL21(DE3)plys细菌，于TB培养基中进行表达，其表达量占菌体总蛋白的10％左右。依次经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换柱、Hiload16/60Superdex75凝胶过滤柱和Hiprep16/10QFF阴离子交换柱纯化，得到了电泳纯的血红色可溶性蛋白。电喷雾质谱测得其分子量为16930.0Da。紫外—可见吸收光谱表明，还原态的NGB在425nm有一强吸收峰，在531nm和559nm处有弱吸收峰，它们可分别归属为金属卟啉的γ、β和α吸收带，氧化态的NGB在413nm处有强吸收，对应于金属卟啉的γ吸收带，是电子在卟啉环中非定域化π电子的轨道跃迁(π→π*)的结果。荧光激发谱最大波长为281nm，发射谱最大波长为338nm。圆二色谱表明其二级结构为典型的α螺旋结构，在410nm处有一血红素正峰。
二、神经红蛋白的荧光光谱研究。用荧光淬灭、荧光探针和同步荧光等方法研究了NGB的荧光特性以及溶液pH和巯基乙醇对NGB构象的影响。荧光淬灭研究表明，氯化铯不能有效地使NGB的色氨酸荧光淬灭，碘化钾可使NGB的色氨酸荧光淬灭较强，当[KI]=0.90mol/L时其淬灭率为35％，而丙烯酰胺可使NGB的色氨酸荧光淬灭80％。CsCl、KI和丙稀酰胺对NGB的荧光淬灭常数Ksv分别为0.13，0.63和3.8。这说明，NGB分子中只有少部分色氨酸处于分子表面且被带正电荷的氨基酸所包围，而大部分色氨酸则埋藏于分子内部的疏水区中。在巯基乙醇存在时，CsCl、KI和丙稀酰胺对NGB的荧光淬灭常数Ksv分别增大为0.28，1.42和4.07，这说明NGB分子中的二硫键对它的结构具有稳定作用。同步荧光研究表明，当波长差是80nm时，神经红蛋白的色氨酸和酪氨酸荧光峰可被分开，色氨酸和酪氨酸的荧光峰强度分别在蛋白浓度为9.0mol/L和6.7μmol/L时具有最大值，在较高浓度时由于存在浓度淬灭效应而降低。pH对神经红蛋白影响的同步荧光和荧光探针研究表明，当溶液pH小于2.0时，神经红蛋白处于酸致变性状态；从pH2.0到pH5.0，神经红蛋白聚集沉淀；从pH5.0到pH11.0，神经红蛋白处于稳定的自然态；而当pH值进一步升高时，神经红蛋白进入其溶剂暴露的碱致变性态。
三、神经红蛋白的去折叠研究。用紫外光谱、荧光探针和荧光相图法研究了在有或无巯基乙醇(2-ME)存在的情况下，神经红蛋白在盐酸胍和尿素中的变性过程。研究结果表明：无2-ME存在时，当盐酸胍浓度超过3.0mol/L时神经红蛋白开始变性，到4.5mol/L变性完全，其变性中点Tm为3.75mol/L。神经红蛋白在盐酸胍中的去折叠过程为一复杂的“五态模型”，N→I1GdmCl→I2GdmCl→U→R。其中I1GdmCl和I2GdmCl是两个可以导致ANS荧光强度显著增强的溶剂暴露变性中间体，R为变性蛋白U的肽链在高浓度盐酸胍下的重新折叠态。在尿素溶液中，当尿素浓度大于5.0mol/L时蛋白开始变性，到9.0mol/L尿素时仍没有变性完全。神经红蛋白在尿素中的变性为“三态模型”，N→IUrea→U。在2-ME存在时情况发生很大变化，蛋白在2.5mol/L盐酸胍中即开始变性，变性中点Tm降为3.38mol/L，变性中间态I1GdmCl消失，变为“四态模型”。同样，在2-ME存在的尿素溶液中，NGB在尿素浓度很小时即开始变性，到8mol/L尿素时即变性完全，而且变性中间态IUrea也消失了，变为简单的“两态模型”。此结果说明：2-ME的存在破坏了蛋白分子内的二硫键，使蛋白分子的稳定性降低，且不利于变性中间体的形成，二硫键在维持蛋白的二级结构和三级结构方面起着重要作用。
四、神经红蛋白的热力学稳定性研究。应用紫外光谱和差示扫描量热法(DSC)等方法探讨了神经红蛋白在水及缓冲液等中的热变性过程，以及溶液pH值、中性盐、溶剂极性等条件对其热力学参数的影响。紫外光谱研究表明，不论在水中还是在缓冲液中该过程至少包括三个变性中间体，它们分别位于337.65K、348.15K和355.15K，在这些状态下神经红蛋白的Soret带紫外吸收均有所增加，但当溶液中存在2-ME时，前两个峰消失。神经红蛋白的DSC研究表明，在水中DSC曲线由两个吸热峰组成，分别位于353.39K和366.94K，其热变性焓△Hd分别为5.954J/g和2.809J/g，两过程分别对应于蛋白质肽链的去折叠和血红素的脱落。而在缓冲液中由于受缓冲液阴离子的影响DSC曲线变为一个峰，如，pH8.0的0.05mol/LTris-HCl中为357.81K，△Hd为9.818J/g。溶液的pH值显著影响神经红蛋白热变性的变性温度和焓变。在Tris-HCl缓冲液中，当溶液pH为8.0时，变性温度和焓变最高，分别为357.81K和9.818J/g。相同pH值的不同缓冲液中蛋白变性的热力学参数不同，因此不同缓冲液对蛋白的影响是不同的，如pH7.2的不同缓冲液变性温度：Na2HPO4-NaH2PO4(359.07K)＞Hepis(356.14K)＞TrisHCl(355.03K)，pH5.8的不同缓冲液变性温度NaAc-HAc(356.59K)＞Na2HPO4-NaH2PO4(354.31K)＞柠檬酸(349.75K)。当在神经红蛋白水溶液中加入NaCl或NaSCN后，它的DSC曲线也是仅含有一个吸热峰，而且随着盐浓度的增大，变性温度和焓变逐渐降低。在甲醇、乙醇或丙醇与水所组成的溶剂体系中，神经红蛋白的两变性峰的变性温度Td随着醇的碳氢链的加长以及浓度的增加而有所降低。此外，神经红蛋白的状态不同，它的热稳定性也不同，蛋白水溶液中加入ME破坏其分子内二硫键后两变性温度Td和焓变△Hd均有所降低，加入连二亚硫酸钠变为还原态后其Td和△Hd分别降为348.08K和3.897J/g，稳定性显著下降。
五、血红素与脱辅基神经红蛋白的结合性研究。用紫外光谱和荧光光谱法研究了血红素与脱辅基神经红蛋白结合的动力学，发现反应分两步完成，第一步为血红素与脱辅基神经红蛋白快速结合形成五配位结构，是二级反应；第二步为五配位结构的神经红蛋白慢慢转化为六配位形式，是一级反应。两步的反应速率常数分别为1.22×105(mol/L)-1·s-1和0.0012s-1。第二阶段的速率常数和反应初速度受温度影响较大，温度较低时，随温度升高而增大，超过40℃时随温度升高而降低，当温度高于80℃后第二步反应不能进行。求得第二步的反应活化能为46.25KJ/mol。
六、NGB的酶催化活性探讨。研究表明，NGB具有一定的类过氧化物酶的酶活性。神经红蛋白催化H2O2氧化邻甲氧基苯酚的最大反应速率Vm和米氏常数Km分别为0.1113min-1和1.433×10-2mol/L，作为模拟酶的催化转化数Kcat为2.226×104mol·L-1·min-1。神经红蛋白由于存在较强的双组氨酸六配位结构，其天然状态下过氧化物酶催化活性并不是太高，但若改变其轴向配体的配位环境，使第六配体更加容易脱离，酶活性将得以大大提高。研究表明，所有使蛋白链不稳定的因素都能提高蛋白的酶活性，甚至于加入2-ME破坏分子内二硫键也能在一定程度上提高其酶活性。尤其在高温、高浓度尿素和强碱等变性条件下，神经红蛋白的酶活性可以提高几十、几百甚至几千倍，这与一般蛋白在变性条件下失活正好相反，有望在高温等恶劣环境中得以应用。