论文部分内容阅读
miRNAs是一类内源性的RNA,是一系列短的、由20-22个核苷酸组成的非编码的核酸,可以通过影响靶mRNA稳定性或者翻译过程,进而对转录后靶基因表达进行调节,与肿瘤细胞的生长、增殖、转移以及凋亡有着至关重要的关系。miRNAs靶向作用于肿瘤相关基因,可抑制肿瘤细胞的生长、促进其衰老、抑制肿瘤细胞的增殖等。CREPT是新发现一种癌基因,其在多种肿瘤组织中存在高表达,有望成为新的治疗靶点。然而,关于CREPT早期研究仅集中于该蛋白在肿瘤发生、发展过程中对下游基因调控机制的研究和蛋白晶体结构的揭示,侧重于CREPT蛋白下游生物学功能探讨,而CREPT基因本身表达水平在肿瘤组织中升高的分子机制尚不清楚。本实验以人类结直肠癌细胞株中CREPT mRNA分子为治疗靶点,通过Target Scan和miRanda等打靶软件预测靶向于CREPT mRNA的miRNAs,并通过查阅文献和相关数据库及相关实验,筛选出打靶于CREPT mRNA的miRNA,即为miR-194。通过双荧光酶素报告基因表达活性检测实验检测出miR-194与CREPT mRNA3’-UTR的精确结合位点,并用Western Blot实验,研究了miR-194对CREPT蛋白水平表达,进一步验证筛选结果。通过细胞计数法、MTT法、克隆形成实验,系统研究了miR-194对结直肠癌细胞HCT 116β/W生长、增殖、克隆形成能力的影响。通过流式细胞仪检测,对miR-194对细胞周期的影响进行探究。结果表明,miR-194打靶于CREPT后,可以抑制HCT116β/W生长和增殖,调控细胞周期,使细胞阻滞于S期。通过Western Blot实验,研究miR-194对细胞周期及对信号通路的影响。结果显示,miR-194靶向于CREPT后,对Wnt信号通路有一定的抑制作用。miR-194打靶于CREPT后,可调节CREPT下游靶标基因,CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin E、C-myc周期相关蛋白表达降低,调控细胞周期。NF-κB p65蛋白表达减少,推测miR-194可调控NF-κB信号通路。本论文通过靶标软件及实验筛选出打靶于CREPT的miRNA,即miR-194,并且探索miR-194打靶CREPT后下游相关基因的变化,并对肿瘤细胞周期等影响,为进一步探索CREPT在肿瘤组织和细胞株中高表达机制提供理论基础。