论文部分内容阅读
AMH作为体内唯一的抑制始基卵泡生长的细胞因子，由颗粒细胞分泌，从两个途径发挥其生物学作用，一方面AMH与颗粒细胞上特异的II型受体(AMHRII)结合,通过胞浆内一类Smad3中介蛋白信号转导至核内，抑制了核内CYP19基因mRNA的表达，降低细胞色素酶P450的活性而下调雌激素的分泌，抑制始基卵泡的募集。另一方AMH作为TGF-β家族成员，通过Smad蛋白影响颗粒细胞内信号通路中的重要转录因子，进而调控各种细胞因子的表达，减弱了这些细胞因子促进细胞分化、血管生成及延长细胞周期的作用。这可能是AMH抑制卵泡募集的主要途径。但关于AMH调控这些细胞因子进而抑制卵泡募集的信号途径尚无报道，若能突破AMH与卵子之间途径的研究，掌握AMH调控此信号途径的具体分子机制，对于保存和延长人类生育力将有着深远的意义。干细胞因子(SCF)属于集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)，颗粒细胞产生的SCF通过与卵细胞膜上的自身配体c-kit结合激活PI3/AKT途径刺激卵细胞及卵泡膜细胞的生长与分化以及类固醇激素的产生，从而加速始基卵泡的生长，因而SCF成为卵巢局部较为重要的生长因子。目前对SCF在卵巢局部促进作用已证实，但关于对SCF在颗粒细胞中表达的调控机制尚不清楚。Eric Nilsson通过体外培养大鼠卵巢，发现AMH可能抑制了SCF促进卵子生长的作用。目前已知AMH和SCF都是颗粒细胞分泌的，AMH的II型受体仅位于颗粒细胞上，而SCF的受体位于卵细胞膜，结合上述研究的结论，推测SCF可能是AMH作用于卵子的媒介之一。也提示我们应对AMH与SCF的关系进行进一步的研究。目前已证实AMH则通过自分泌与旁分泌的方式抑制cAMP中CREB的磷酸化，减少雌激素合成酶的转录。而SCF启动区存在cAMP反应元件CREB的结合位点，且cAMP/PKA途径可增强SCF的转录。根据前期研究结果和上述文献,我们推测AMH可能通过抑制cAMP/PKA途径减弱SCF的转录。由此提出研究假设：在颗粒细胞中AMH通过抑制cAMP途径中CREB的磷酸化，减弱SCF启动子活性,下调SCF基因的转录，从而减弱SCF促进卵子生长启动的作用，最终抑制卵泡募集。本研究分为三部分，第一章研究行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者血清、卵泡液、及颗粒细胞中AMH与SCF蛋白及mRNA表达水平的相关性，第二章采用人黄素化颗粒细胞原代培养，研究不同浓度的AMH对SCF分泌的影响，从细胞水平研究AMH影响颗粒细胞分泌SCF功能的机制。第三章采用cAMP激动剂或阻断剂（H89）与rhAMH联合、单独处理体外培养人黄素化颗粒细胞，应用RT-PCR技术半定量检测体外培养人黄素化颗粒细胞SCFmRNA的表达，从分子水平探讨AMH是否通过抑制cAMP/PKA途径影响颗粒细胞SCF分泌过程。第一章AMH与SCF在血清及卵巢局部表达相关性的研究研究对象：选择2009年1月-2012年9月期间就诊于宁夏医科大学总医院生殖医学中心不孕患者共235例,平均年龄32.33±2.46岁，行体外受精体外胚胎移植（IVF-ET）78例，入选研究对象均测量其身高，体重，计算平均体重指数即体重/身高（2BMI）20.45±1.61，实验对象的具体筛选标准为：月经周期规律，经超声监测合并黄体期孕酮水平检测证实排卵功能正常，卵泡刺激素水平在正常范围（月经周期第3天FSH<15IU/l），无多囊卵巢综合征、高泌乳素血症及子宫内膜异位症，并排除全身其它系统疾病。研究方法：ELISA检测不孕症患者月经周期第3天早晨空腹静脉血清及卵泡液中AMH及SCF蛋白水平；real-time RT-PCR检测人颗粒细胞AMH及SCFmRNA水平表达,比较分析二者的相关性。结果：235例患者血清中AMH与SCF蛋白水平无明显相关性（r=0.57,P=0.33）。其中78例IVF-ET患者中获得55例卵泡液及31例颗粒细胞。55例卵泡液中AMH与SCF蛋白水平有显著相关性(r=-0.65; P＜0.05)；31例颗粒细胞中AMH与SCFmRNA有显著负相关(r=-0.79; P<0.01)。结论1.人黄素化颗粒细胞中AMH与SCFmRNA存在明显负相关性。2.人卵泡液中AMH与SCF蛋白水平呈明显负相关性。3.不同卵巢反应患者血清中AMH表达有差异，SCF表达无差异。4．卵巢功能正常患者血清中AMH与SCF蛋白水平无明显相关性。第二章AMH对体外培养颗粒细胞分泌SCF的影响研究对象：人黄素化颗粒细胞来自15例因单纯男方因素行IVF-ET不孕患者，年龄22-28岁，均选用长方案超排卵，即在月经周期的黄体中期皮下注射长效达菲林1.25mg进行降调节,于月经周期第3天应用高纯度卵泡刺激素(FSH-HP)150-450IU/d进行超促排卵,至卵泡直径至少3个≥16mm,肌注人绒毛膜促性腺激素hCG10000IU,注射hCG36小时后在超声引导下经阴道取卵。COV434细胞购自美国ATCC细胞库。研究方法：1.人黄素化颗粒细胞的原代培养，按活细胞1.0×105个/ml的密度接种于含10％胎牛血清DMEM培养基的24孔板内,培养24小时后更换无血清DMEM，按实验需要分为4组：空白组、AMH10ng/ml组、15ng/ml组、20ng/ml组。2.利用基因克隆、RNA干扰技术构建pGCsi-shRNA-AMH载体并转染COV434细胞系，经鉴定传染成功后，继续培养72小时，real-time RT-PCR检测每组颗粒细胞SCFmRNA表达。免疫组化检测对照组和实验组颗粒细胞SCF蛋白。结果：1.实验组颗粒细胞表达SCFmRNA显著低于空白对照组(p<0.05)，其中20mg/mlrhAMH组显著减少颗粒细胞SCFmRNA表达(p<0.001)。2. pGCsi-shRNA-AMH载体并转染COV434细胞系,SCFmRNA及蛋白水平较空白对照组及阴性组显著增高(p<0.05)。结论：1. AMH可降低人卵巢黄素化颗粒细胞SCFmRNA及蛋白的表达，随AMH浓度的增加抑制作用有增强趋势。2. COV434细胞系经干预AMH基因表达后，SCFmRNA及蛋白的表达增多。第三章AMH通过cAMP/PKA途径对人卵巢黄素化颗粒细胞SCF表达调控实验对象：人黄素化颗粒细胞均来自于2013年4月至2013年9月美国东弗吉尼亚医学院Jones生殖医学研究所（The Jones Institutions for Reproductive Medicine inEastern Virginia Medical School）进行体外受精-胚胎移植的患者，共37例。年龄26岁-37岁，不孕因素均为输卵管因素和男方因素。研究方法：采用不同浓度cAMP（1nM,2nM,3nM,4nM）干预体外培养颗粒细胞，筛选出最适浓度;研究在阻断cAMP/PKA（加入cAMP/PKA抑制剂H89）后AMH对人卵巢颗粒细胞SCF分泌的影响。体外培养人黄素化颗粒细胞分为6组：空白对照组、AMH20ng/ml组、cAMP3nM组、AMH20ng/ml+cAMP3nM、AMH20ng/ml+H89、cAMP3nM+H89组。采用Western Blot、real-time RT-PCR及免疫组化等技术检测体外培养人颗粒细胞中SCF的mRNA及蛋白的表达。结果：1.实验组颗粒细胞表达SCFmRNA显著高于空白对照组(p<0.05)，cAMP1nM到3nM组之间有剂量依赖性。cAMP3nM到4nM组比较无显著性差异（p>0.05）。2. rhAMH+cAMP组与cAMP组比较，颗粒细胞SCFmRNA、蛋白的分泌减少(p<0.05)；与对照组比较则无差异(p>0.05)。AMH可抑制cAMP促进人卵巢黄素化颗粒细胞SCFmRNA及蛋白的表达。3. cAMP+H89组与cAMP组比较，颗粒细胞SCFmRNA、蛋白的分泌显著减少(p<0.01)；与对照组比较则无差异(p>0.05)。H89可阻断cAMP促进人卵巢黄素化颗粒细胞SCF表达的作用。4. rhAMH+H89组与rhAMH组比较,颗粒细胞SCFmRNA，蛋白的分泌显著增多；与对照组比较则无差异。H89可阻断rhAMH抑制人卵巢黄素化颗粒细胞SCF表达的作用。结论：AMH通过cAMP/PKA途径抑制人卵巢黄素化颗粒细胞SCF的表达。