论文部分内容阅读
目的恶性肿瘤是影响我国居民身心健康的主要慢性病之一。随着应用分子诊断技术的发展和精准医疗概念的提出,越来越多的研究者认识到不断探索新的生物标记物不仅可以更加精确地判断肿瘤患者的预后,而且可以指导治疗。水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)是水通道蛋白家族中最早被发现且分布最为广泛的成员。研究表明,AQP1蛋白在多种肿瘤组织中存在异常表达,并且可以调节肿瘤细胞的恶性生物学行为。本研究旨在通过检测AQP1蛋白在人乳腺癌组织及恶性星形胶质细胞瘤组织中的表达情况,分析其与患者临床病理学参数和预后的关系,进而阐明AQP1蛋白表达的临床意义。另外,通过构建AQP1基因稳定表达的细胞系,明确AQP1蛋白对肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等多种生物学行为的影响及可能存在的分子机制。方法第一部分1.本研究随机选取了天津医科大学肿瘤医院2004至2007年间确诊的33例乳腺良性病变(benign lesions)、45例乳腺导管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)及341例浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)病例及患者组织蜡块,利用免疫组织化学染色技术检测AQP1蛋白的亚细胞定位情况及表达水平。2.分析AQP1蛋白的表达水平与IDC患者临床病理学参数的关系。3.随机选取50例伴有腋淋巴结转移的IDC患者,收集其肿瘤原发灶组织蜡块和配对淋巴结转移灶组织蜡块,比较AQP1蛋白在肿瘤原发灶和淋巴结转移灶中的表达。4.对患者进行随访,分析AQP1的表达对不同分子亚型乳腺癌患者预后的影响。第二部分1.利用Western blot技术检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中AQP1的表达情况并构建AQP1基因稳定表达的乳腺癌细胞系。构建插入m GFP荧光标签的重组慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-m GFP,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7,用嘌呤霉素(puro)筛选阳性克隆(对照组,细胞分别命名为vector/MDA-MB-231和vector/MCF7);将AQP1插入双酶切后线性化的重组慢病毒载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7,用puro筛选阳性克隆(实验组,细胞分别命名为AQP1/MDA-MB-231和AQP1/MCF7)。用荧光显微镜观察外源性AQP1蛋白在细胞中的定位情况。2.构建插入3×Flag标签的重组慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-3×Flag,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,用puro筛选阳性克隆(对照组,细胞命名为3×Flag-vector/MDA-MB-231);将AQP1插入双酶切后线性化的重组慢病毒载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,用puro筛选阳性克隆(实验组,细胞命名为3×Flag-AQP1/MDA-MB-231)。利用免疫荧光实验检测外源性AQP1蛋白在细胞中的定位情况。3.利用免疫荧光实验检测内源性AQP1蛋白在原代培养的乳腺癌细胞中的亚细胞定位情况。4.利用Brd U标记实验、软琼脂克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测AQP1蛋白对乳腺癌细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力的影响。第三部分1.随机选取160例天津医科大学肿瘤医院2004至2012年间确诊的恶性星形胶质细胞瘤病例及患者组织蜡块,利用免疫组织化学S-P法检测AQP1蛋白和β-catenin蛋白的表达情况。2.利用Western blot技术检测胶质瘤细胞系LN229中AQP1蛋白的表达情况并构建AQP1基因稳定表达的胶质瘤细胞系。对照组:构建插入m GFP荧光标签的重组慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-m GFP,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染LN229细胞,用puro筛选阳性克隆(细胞命名为vector/LN229)。实验组:将AQP1插入双酶切后线性化的重组慢病毒载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒并感染胶质瘤细胞LN229,用puro筛选阳性克隆(细胞命名为AQP1/LN229)。利用Western blot技术验证目的蛋白过表达效率。3.利用免疫荧光实验、免疫共沉淀实验等方法验证AQP1和β-catenin的关系。4.构建β-catenin稳定干扰的胶质瘤细胞系。利用慢病毒干扰质粒PLKO.1-shβ-catenin制备慢病毒并感染AQP1/LN229细胞。筛选稳定表达shβ-catenin的克隆,并利用细胞功能学实验检测敲降β-catenin对AQP1/LN229细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。5.探索联合评价AQP1和β-catenin的表达情况对恶性星形胶质细胞瘤患者预后的预测价值。结果第一部分1.在乳腺良性病变和导管原位癌组织中,AQP1主要定位于乳腺导管肌上皮的细胞膜。在浸润性导管癌组织中,AQP1主要定位于肿瘤细胞的胞浆。2.AQP1的胞浆表达水平与患者肿瘤大小(rs=0.130,P=0.020)、组织学分级(rs=0.186,P=0.001)、淋巴结转移状态(rs=0.129,P=0.020)、病理学分期(rs=0.202,P=0.000)、复发或远处转移状态(rs=0.138,P=0.013)呈正相关;与雌激素受体状态(rs=-0.120,P=0.031)、孕激素受体状态(rs=-0.159,P=0.004)呈负相关;而与年龄(rs=0.082,P=0.139)和人类表皮生长因子受体2状态(rs=0.075,P=0.178)无显著相关性。3.AQP1在淋巴结转移灶中的表达水平显著高于配对的肿瘤原发灶。4.Kaplan-Meier生存分析结果显示,AQP1高表达的患者总生存期和无进展生存期均显著缩短(OS:P=0.001,PFS:P=0.002)。AQP1被证明是IDC患者的独立预后因子(OS:HR 2.439,95%CI 1.109-5.366,P=0.027;PFS:HR 1.740,95%CI 1.013-2.989,P=0.045)。另外,AQP1主要影响管腔型(包括管腔A型和管腔B型)乳腺癌患者的生存。第二部分1.Western blot检测发现,MDA-MB-231和MCF7中无内源性AQP1蛋白的表达。经慢病毒感染后,细胞中目的蛋白的表达水平显著升高。外源性AQP1蛋白定位于AQP1/MDA-MB-231细胞的胞浆。2.免疫荧光实验证明,外源性AQP1蛋白定位于3×Flag-AQP1/MDA-MB-231细胞的胞浆。3.在原代培养的乳腺癌细胞中,内源性AQP1蛋白定位于肿瘤细胞的胞浆。4.AQP1蛋白过表达后,细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力均显著增强。第三部分1.在低级别(II级)星形胶质细胞瘤组织中,AQP1主要定位于肿瘤细胞的胞膜,而在高级别星形胶质细胞瘤(III级和IV级)组织中,AQP1同时定位于肿瘤细胞的胞膜和胞浆。AQP1的表达与β-catenin呈正相关(rs=0.158,P=0.045)。2.Western blot检测显示,胶质瘤细胞系LN229中无内源性AQP1蛋白的表达。经慢病毒感染后,细胞中目的蛋白的表达水平显著升高。外源性AQP1蛋白定位于AQP1/LN229细胞的胞浆。3.免疫荧光实验结果显示,AQP1与β-catenin共定位于AQP1/LN229细胞的胞浆。过表达AQP1蛋白后,LN229细胞内β-catenin的表达上调。免疫共沉淀实验结果显示,AQP1与β-catenin发生免疫共沉淀,提示两者存在相互作用。4.干扰AQP1/LN229细胞中β-catenin的表达后,细胞增殖、迁移及侵袭能力均显著下降。5.联合评估AQP1和β-catenin的表达,能够更精确地判断恶性星形胶质细胞瘤患者的预后。AQP1和β-catenin同时低表达提示患者预后较好;AQP1或β-catenin中任何一者高表达,提示患者预后差。结论1.在浸润性导管癌组织中,AQP1蛋白主要定位于肿瘤细胞的胞浆。2.AQP1的胞浆表达水平与乳腺癌患者的多项临床病理学参数呈正相关。3.AQP1的胞浆表达水平与乳腺癌患者的生存预后呈显著负相关,AQP1高表达的患者预后较差,其总生存期和无进展生存期均明显缩短。Cox多因素风险回归模型结果表明,AQP1的胞浆表达水平是乳腺癌患者的独立预后因子。4.AQP1可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。5.在低级别恶性星形胶质细胞瘤组织中,AQP1主要定位于肿瘤细胞的胞膜;在高级别恶性星形胶质细胞瘤组织中,AQP1同时定位于肿瘤细胞的胞膜和胞浆。6.AQP1与β-catenin存在相互作用。过表达AQP1蛋白后,LN229细胞内β-catenin的表达上调。7.敲降AQP1/LN229细胞中β-catenin的表达后,细胞增殖、运动及侵袭能力均显著降低。8.联合评估AQP1和β-catenin的表达,能够更精确地判断恶性星形胶质细胞瘤患者的预后。