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背景与目的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞失去其特性,进而获得间质细胞的特性。EMT的发生在胚胎发育、组织修复、纤维化的发生中具有重要作用。上皮间质转化的主要原因是肺组织上皮细胞受到刺激,尤其是转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的刺激后,上皮细胞异常修复,发生间充质转化。而上皮细胞向间质细胞转化的过程中,形成的中间细胞形态肌成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白(extracellular matrix,ECM),造成过度沉积,最终导致肺功能失调。TGF-β属于多功能的细胞因子,是体外构建EMT模型的经典细胞因子。当细胞受到缺血、过高热、毒素、病毒性颗粒等刺激时,合成一组高度保守的蛋白,被称为“热休克蛋白”(heat shock proteins,HSP),HSP70是HSP家族的核心成员。最近有研究表明,在临床上被用于治疗胃溃疡的药物—替普瑞酮(geranylgeranylacetone,GGA),作为无毒的HSP70的诱导剂被报道证实。因此,本实验通过TGF-β刺激A549细胞构建体外EMT模型,然后通过替普瑞酮诱导HSP70高表达以探索HSP70对EMT模型的影响。在此次实验中利用western blot检测NOX4、HSP70及EMT相关蛋白E-cadherin、vimentin的表达,应用活细胞工作站观察细胞形态变化,并用划痕实验检测HSP70对细胞迁移能力的影响,进而探索HSP70对EMT进程的调节作用。方法1.TGF-β刺激A549细胞构建EMT模型实验分别为空白组和模型组,其中空白组只加入RPMI1640培养基,模型组加入TGF-β使其终浓度为5μg/L,刺激A549细胞24h,收集各组蛋白,应用western blot检测各组中E-cadherin、vimentin、HSP70、NOX4蛋白的表达。2.筛选GGA的最优浓度和最佳时间首先用不同浓度的GGA(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)刺激A549细胞24小时,然后收集各组的蛋白,应用western blot检测HSP70的表达,以筛选出最优浓度;根据最优浓度分别在不同时间点(0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h)刺激A549细胞,收集不同时间点的蛋白,应用western blot检测HSP70的表达筛选出最佳时间。3.GGA诱导的HSP70对A549细胞EMT的影响根据筛选出的GGA最优浓度,实验分为50μmol/L和200μmol/L;每个浓度都分为5组,分别为空白组、DMSO组、TGF-β组、TGF-β+GGA组、GGA组,然后收集各组的蛋白,用western blot检测各组中的EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达。4.GGA诱导的HSP70对A549细胞形态的影响根据筛选出的GGA最优浓度,实验分为50μmol/L/和200μmol/L;每个浓度都分为5组,分别为空白组、DMSO组、TGF-β组、TGF-β+GGA组、GGA组,应用活细胞工作站观察细胞形态变化,并对其进行拍照。5.GGA诱导的HSP70对A549细胞迁移能力的影响根据筛选出的GGA最优浓度,实验分为50μmol/L/和200μmol/L;每个浓度都分为5组,分别为空白组、DMSO组、TGF-β组、TGF-β+GGA组、GGA组,应用划痕实验来检测GGA诱导的HSP70对A549细胞迁移能力的影响。结果1.与空白组比较,在TGF-β诱导的A549细胞EMT模型组,E-cadherin表达水平降低,HSP70、vimentin、NOX4蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.在筛选刺激A549细胞的最优GGA浓度时,与0μmol/L组比较,50μmol/L组HSP70蛋白表达水平升高,与100μmol/L组比较,200μmol/L组HSP70蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。筛选GGA刺激A549细胞最佳时间时,与0μmol/L组比较,刺激A549细胞24h时,HSP70蛋白表达水平最高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.用50μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对EMT相关蛋白的影响:与空白组比较,TGF-β组E-cadherin表达降低,vimentin表达升高,TGF-β+GGA组E-cadherin和vimentin均表达升高,GGA组vimentin表达升高;与TGF-β组比较,TGF-β+GGA组vimentin表达水平升高,GGA组E-cadherin表达水平升高;与TGF-β+GGA组比较,GGA组E-cadherin表达水平升高,vimentin表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。用200μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对EMT相关蛋白的影响:与空白组比较,TGF-β组的E-cadherin表达水平降低,vimentin表达升高;TGF-β+GGA组E-cadherin表达水平降低,GGA组E-cadherin和vimentin表达水平均降低;与TGF-β组比较,TGF-β+GGA组和GGA组的E-cadherin表达水平升高,vimentin表达水平降低;与TGF-β+GGA组比较,GGA组E-cadherin表达水平升高,vimentin表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.用50μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对细胞形态的影响:与空白组比较,TGF-β组的细胞更加细长,呈纤维状;但单独加入GGA时,细胞边缘变的更圆。用200μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对细胞形态的影响,与空白组比较,TGF-β组的细胞更加细长,呈纤维状;与TGF-β组比较,TGF-β+GGA组细胞边缘更倾向于圆钝,单独加入GGA时,细胞更加圆钝。5.用50μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对细胞迁移能力的影响:与空白组比较,TGF-β组和TGF-β+GGA组的划痕宽度变窄,GGA组的划痕宽度变宽;与TGF-β组比较,TGF-β+GGA组和GGA组的划痕宽度都变宽,;与TGF-β+GGA组比较,GGA组的划痕宽度变宽,差异均有统计学意义(P<0.05)。用200μmol/L GGA处理A549细胞时,其诱导的HSP70对细胞迁移能力的影响:与空白组比较,TGF-β组的划痕宽度变窄,TGF-β+GGA组和GGA组的划痕宽度变宽;与TGF-β组比较,TGF-β+GGA组和GGA组的划痕宽度都变宽,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.HSP70抑制TGF-β诱导的A549细胞EMT进程。2.HSP70改变TGF-β诱导的A549细胞形态及A549细胞的迁移能力。3.HSP70可能是EMT进程中的一个重要靶点。